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【编辑推荐】为阐明 Hsp90-Aha1 互作机制及靶向药物开发问题，研究人员以苯溴马隆为探针，结合结构生物学与细胞实验，发现其通过结合 Hsp90-NTD 和 Aha1-CTD 干扰两者互作，抑制 ATP 酶活性并诱导肿瘤细胞凋亡，为抗肿瘤药物研发提供新方向。
在生命科学领域，分子伴侣的研究一直是揭示细胞奥秘的关键一环。热休克蛋白 90（Hsp90）作为最重要的分子伴侣之一，宛如细胞内蛋白质折叠的 “高级工程师”，参与调控约 400 种客户蛋白的构象，其中不乏与肿瘤发生密切相关的激酶（如 Src、AKT）、转录因子等。其协同伴侣蛋白 Aha1 更是独特，作为唯一能显著增强 Hsp90 ATP 酶活性的分子，二者形成的 Hsp90-Aha1 系统如同肿瘤细胞生长的 “助推器”，通过维持癌蛋白稳态促进肿瘤进展。然而，Aha1 的作用模式尤其是其 C 端结构域（Aha1-CTD）与 Hsp90 的结合机制尚不明晰，且针对该系统的小分子抑制剂开发面临靶点结合口袋不明确的瓶颈 —— 这就像锁匠面对一把结构未知的锁，难以打造精准的钥匙。因此，解析 Hsp90 与 Aha1 的互作机制并寻找有效的干扰分子，成为抗肿瘤药物研发的迫切需求。
中国科学院上海药物研究所的研究团队瞄准这一科学难题，开展了一项极具创新性的研究。他们以临床用于治疗高尿酸血症的药物苯溴马隆（Benzbromarone）为突破口，发现其竟能 “跨界” 作用于 Hsp90-Aha1 系统，并深入探究了其中的分子机制。这项成果发表在《Communications Biology》，为 Hsp90-Aha1 靶向治疗开辟了新视野。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过核磁共振（NMR）、等温滴定量热法（ITC）验证苯溴马隆与 Hsp90-NTD（N 端结构域）和 Aha1-CTD 的结合；利用 X 射线晶体衍射解析 Aha1-CTD 与苯溴马隆的高分辨率复合物结构；借助冷冻电镜（cryo-EM）观察 Hsp90:Aha1 复合物的构象变化；采用 NADH 偶联 ATP 酶活性测定和 31P NMR 检测酶活性变化；通过细胞热转移实验（CETSA）证实细胞内相互作用，并运用流式细胞术、免疫印迹等评估细胞毒性和信号通路变化。
苯溴马隆与 Hsp90-NTD 和 Aha1-CTD 的结合特征
研究首先通过分子互作实验证实，苯溴马隆能以纳摩尔至低微摩尔级亲和力特异性结合 Hsp90-NTD 和 Aha1-CTD。NMR 滴定显示，Hsp90-NTD 中 ATP 结合口袋的关键残基（如 I26、R46、F138 等）在药物存在下信号显著衰减或化学位移改变，表明药物占据了该区域。X 射线晶体结构则揭示，Aha1-CTD 通过 α3 螺旋、β3-β4 环和 α2-β2 环形成的疏水腔与苯溴马隆结合，其中 F235、W319 等残基通过范德华力稳定复合物，且结合后口袋体积从 188?3 扩大至 205?3，展现出诱导契合的结合模式。
苯溴马隆干扰 Hsp90-Aha1 互作并抑制 ATP 酶活性
竞争性结合实验显示，在 ATP 类似物 AMPPNP 存在下，苯溴马隆能有效阻断 Aha1-CTD 与 Hsp90-NTD 的相互作用 —— 当药物加入时，Aha1-CTD 的特征性化学位移扰动模式更接近单独与药物结合的状态，而非与 Hsp90-NTD 结合的状态。功能实验表明，苯溴马隆可剂量依赖性抑制 Hsp90 的 ATP 水解速率，即便在 Aha1 存在增强酶活性的情况下，药物仍能显著逆转这一过程，提示其通过干扰 Hsp90-Aha1 协同作用抑制分子伴侣功能。
苯溴马隆的肿瘤细胞毒性及作用机制
在多种肿瘤细胞（包括结直肠癌细胞、骨肉瘤细胞、前列腺癌细胞）中，苯溴马隆表现出剂量依赖性细胞毒性，IC??值在数十微摩尔级别。细胞热转移实验证实，药物可提高 Hsp90 和 Aha1 在细胞内的热稳定性，表明二者在生理环境中确实发生互作。进一步研究发现，药物可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，通过下调 N - 钙黏蛋白（N-Cadherin）、上调 E - 钙黏蛋白（E-Cadherin）抑制上皮 - 间质转化（EMT）过程；同时诱导细胞凋亡，表现为 Annexin V-FITC/PI 双染阳性细胞比例增加， cleaved PARP 和 cleaved caspase-3 表达上调；并导致细胞周期阻滞于 G2/M 期。免疫印迹显示，Hsp90 的客户蛋白 AKT、CDK2、CDK4 及雄激素受体（AR）的表达水平显著下降，而热休克反应相关蛋白 Hsp70、HSF1 未被诱导，表明药物特异性干扰 Hsp90 系统而非触发非特异性应激反应。
研究结论与意义
本研究首次揭示了苯溴马隆作为 Hsp90-Aha1 系统双功能调节剂的分子机制：其通过结合 Hsp90-NTD 的 ATP 口袋（虽与 AMP-PNP 结合位点部分重叠但取向不同）和 Aha1-CTD 的疏水腔，动态干扰两者的互作网络，从而抑制 Hsp90 的 ATP 酶活性及客户蛋白稳态维持功能。这种 “双位点打击” 模式为设计高特异性 Hsp90-Aha1 抑制剂提供了结构基础。更重要的是，作为已上市药物，苯溴马隆的抗肿瘤新用途展现了 “老药新用” 的潜力，其作用机制的阐明不仅丰富了 Hsp90 分子伴侣系统的调控理论，也为开发靶向肿瘤细胞内异常蛋白稳态的治疗策略提供了全新方向。未来，基于该化合物的结构优化有望诞生高效低毒的抗肿瘤新药，为攻克依赖 Hsp90-Aha1 通路的恶性肿瘤带来希望。
