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问题 2
为阐明酵母内吞作用中 Las17/WASP 介导肌动蛋白聚合的时空调控机制，研究人员聚焦 Las17 与调控因子 Sla1 SH3 结构域及肌动蛋白的互作。发现 Sla1 串联 SH3 结构域与 Las17 结合力比单个强 > 100 倍，且与 G - 肌动蛋白竞争性结合 Las17 多脯氨酸区，为理解内吞调控提供新视角。
问题 5
在细胞的生命活动中，肌动蛋白细胞骨架的动态调控至关重要，尤其是肌动蛋白丝的从头起始过程。尽管已知 WASP 家族蛋白在肌动蛋白成核中起关键作用，但其调控机制，特别是 Las17/WASP（酵母中关键的肌动蛋白聚合起始因子）如何被精确激活与抑制，仍存在显著空白。例如，适配蛋白 Sla1 通过其 SH3 结构域抑制 Las17 的机制尚不明确，且 Las17 的多脯氨酸区域（PPR）在肌动蛋白聚合中的具体功能也需深入探究。为解决这些问题，英国谢菲尔德大学（University of Sheffield）的研究团队开展了系列研究，相关成果发表在《Communications Biology》。
研究人员采用了多种关键技术：
- 微尺度热泳动（MST）：用于测量蛋白间结合亲和力，如 Las17 与 G - 肌动蛋白、Sla1 SH3 结构域的结合常数。
- 生物层干涉术（BLI）：分析 Sla1 SH3 结构域与 Las17 PPR 的相互作用强度。
- 核磁共振（NMR）：解析 Sla1 SH3#1&2 的结构及与 Las17 肽段的结合模式。
- 全内反射荧光显微镜（TIRFm）：观察肌动蛋白丝的生长动态及分支情况。
- 酵母遗传学与活细胞成像：通过突变体分析（如 las17 P387A）研究体内功能。
研究结果
1. 串联 SH3 结构域对 Las17 的抑制作用
通过 BLI 和 MST 发现，Sla1 的 SH3#1&2 串联结构域与 Las17 PPR-N 的结合亲和力（87 nM）比单个 SH3 结构域（7.5 μM）高近 100 倍，且三个 SH3 结构域联合时亲和力进一步提升（39 nM）。体外肌动蛋白聚合实验表明，只有串联 SH3 结构域能有效抑制 Las17-Arp2/3 介导的聚合反应，暗示结合亲和性对抑制功能至关重要。
2. Sla1 SH3 结构域与 Las17 的结合机制
利用 AlphaFold2 和 NMR 解析结构显示，SH3#1&2 形成刚性二聚体，其脯氨酸螺旋结合面呈 180° 排列，需至少 28 个氨基酸间隔的两个脯氨酸基序结合。NMR 滴定实验证实，Las17 的三个多脯氨酸基序（PP1-3）均与 SH3#1&2 结合，但 SH3#1 亲和力高于 SH3#2，SH3#3 主要结合 PP1。
3. Las17 PPR 的肌动蛋白结合位点
通过 MST 和突变分析，在 Las17 PPR-N（300-422）中鉴定出三个肌动蛋白结合位点（ABS1-3），分别与 PP1-3 重叠。每个位点的精氨酸对（如 RR349,350；RR382,383）突变会显著降低与 G - 肌动蛋白的结合亲和力，其中 ABS2 和 ABS3 为主要结合位点。结构建模显示，Las17 的脯氨酸基序及侧翼精氨酸与 G - 肌动蛋白的带正电荷凹槽（如 E334、E361/364）相互作用，三个肌动蛋白单体可沿 Las17 PPR 纵向结合，类似 Spire 等成核因子的模式。
4. SH3 与肌动蛋白的竞争性结合及调控因子作用
竞争结合实验表明，Sla1 SH3#1-3 可使 Las17 与肌动蛋白的结合亲和力降低 40 倍，证实两者直接竞争 PPR 结合位点。小 GTP 酶 Sec4 可通过结合 Las17 的 PP1 区域，解除 Sla1 的抑制并促进肌动蛋白聚合，其机制可能与 Sec4 破坏 SH3 结合有关。此外，Sla1 的 PH 样结构域可结合膜脂，但其单独无法解除抑制，提示需多因子协同作用。
5. Las17 突变体的体内功能验证
las17 P387A 突变体因减少 SH3 结合但保留肌动蛋白结合，导致酵母内吞缺陷：肌动蛋白极化异常、内吞速率减慢，且 Arp2/3 复合物招募延迟。活细胞成像显示，突变体中 Las17-GFP 在膜上的驻留时间延长，伴随 Abp1-GFP 和 Arc15-mCherry 的异常行为，表明 SH3 与肌动蛋白的结合平衡对时空调控至关重要。
结论与讨论
本研究揭示了 Las17/WASP 活性调控的核心机制：Sla1 通过串联 SH3 结构域的高亲和性结合，阻断 Las17 PPR 的肌动蛋白结合位点，从而抑制聚合；而 Sec4 等因子通过竞争结合或结构重塑解除抑制，允许肌动蛋白成核。这一竞争性结合模型解释了为何 SH3 结构域虽远离 Las17 的 VCA 结构域（结合 Arp2/3 和肌动蛋白），却能远程调控聚合活性。此外，Las17 PPR 的多肌动蛋白结合位点及其与 Spire 等成核因子的相似性，提示其可能通过纵向排列肌动蛋白单体介导从头成核，为 Arp2/3 依赖的分支网络提供起始模板。
该研究不仅填补了 WASP 家族蛋白调控机制的空白，还为理解内吞作用的时空协调性提供了分子基础，并为相关疾病（如肌动蛋白细胞骨架异常导致的免疫缺陷或发育障碍）的研究提供了新靶点。未来可进一步探索其他调控因子（如泛素、Sla2）与 SH3 结构域的互作，以及 Las17 在不同细胞环境中的功能差异。
