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为解决子宫微生物组分析因微生物生物量极低而面临的挑战，研究人员开展马子宫细胞刷样本的 RNA 和 DNA-based 16S rRNA 基因 V3-V4 扩增子测序比较研究。结果显示 RNA-based 方法灵敏度更高，两者菌群组成有差异，联合分析具重要价值。
子宫，这个曾被认为是 “无菌圣殿” 的神秘器官，随着微生物组研究的深入，其隐藏的微生物世界逐渐揭开面纱。越来越多证据表明，子宫微生物组的组成与子宫内膜容受性、妊娠结局等生殖健康问题密切相关。然而，极低的微生物生物量使得子宫微生物组的分析困难重重，传统的 DNA-based 16S 扩增子测序面临诸多局限，如无法准确区分活细菌与死细菌、受 rRNA 基因拷贝数偏倚影响等。而 RNA-based 分析虽能反映活跃细菌情况，但同样存在核糖体数量差异带来的偏差。如何更全面、准确地解析子宫微生物组，成为生殖医学和微生物组研究领域的关键问题。
为了攻克这些难题，瑞士苏黎世大学（University of Zurich）的研究人员开展了一项具有创新性的研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员以马为研究对象，选取 14 匹母马的子宫细胞刷样本（部分因持续性繁殖诱导子宫内膜炎等问题导致不孕），旨在建立高灵敏度和特异性的 16S rRNA 基因 V3-V4 区扩增子 PCR 方法，并比较基于 RNA 和 DNA 的 16S 扩增子测序在子宫微生物组分析中的差异。
研究主要采用了以下关键技术方法：首先，通过改良的 AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit 从同一细胞刷样本中同时提取 DNA 和 RNA；其次，优化 16S rRNA 基因 V3-V4 区扩增子 PCR 协议，引入 12S rRNA 阻断寡核苷酸抑制宿主 DNA 干扰，使用 Platinum? Taq DNA 聚合酶等试剂提高特异性和灵敏度；最后，利用 Illumina NextSeq2000 进行高通量测序，并通过 QIIME 2 等工具进行生物信息学分析，计算 α 多样性（如 Shannon、Simpson、Chao1 指数）和 β 多样性（如 Jaccard 和 Bray-Curtis 相异指数），开展差异丰度分析等。
研究结果
优化的扩增子 PCR 协议具有高灵敏度和特异性
研究发现，DNA-based 扩增子 PCR 能检测到低至约 38 个细菌基因组拷贝的标准品，而 RNA-based 方法（从 cDNA 开始）的灵敏度估计比 DNA-based 方法至少高 10 倍。通过引入 12S rRNA 阻断寡核苷酸（3’- 氨基修饰），有效抑制了马线粒体 12S rRNA 基因的非特异性扩增，提高了目标区域的扩增效率。
RNA 和 DNA-based 分析在微生物多样性和组成上存在显著差异
RNA-based 分析检测到的扩增子序列变体（ASVs）和分类单元数量显著多于 DNA-based 分析。α 多样性分析显示，两者的 Shannon 指数无显著差异，但 RNA-based 分析的 Simpson 和 Chao1 指数更高，表明其物种丰富度更高。β 多样性分析表明，DNA 和 RNA 样本的微生物群落组成存在明显分离，RNA-based 分析能检测到更多低丰度分类单元。
差异丰度分析揭示两者在各分类水平的差异
在门水平，变形菌门（Proteobacteria）在 RNA 样本中相对丰度更高，而厚壁菌门_D（Firmicutes_D）、放线菌门（Actinobacteriota）等在 DNA 样本中丰度更高。在属水平，如慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）在 RNA 样本中丰度极高，而在 DNA 样本中丰度极低，这可能与该菌的 rRNA 基因拷贝数低（仅 1 个）但核糖体数量多有关；而像阴沟杆菌属（Cloacibacterium）等在 DNA 样本中的丰度比 RNA 样本高数千倍，提示 DNA-based 分析可能检测到死细菌或游离 DNA。
联合分析可提供互补信息
尽管存在差异，配对的 DNA 和 RNA 样本的整体微生物组成相似。研究认为，DNA-based 分析的偏倚主要来自 rRNA 基因拷贝数（1-21），而 RNA-based 分析受每个细胞核糖体数量影响，两者联合分析能更全面地反映子宫微生物组，包括活跃菌群和死菌 / 游离 DNA 的信息，这对于子宫内膜炎、不孕等生殖疾病的诊断和机制研究具有重要价值。
研究结论与讨论
本研究建立了适用于低生物量子宫样本的高灵敏度 16S 扩增子测序方法，系统比较了 RNA 和 DNA-based 分析的优缺点。结果表明，RNA-based 方法在检测低丰度和活跃细菌方面更具优势，而 DNA-based 分析可提供死菌或游离 DNA 的信息。两者的差异源于各自的技术原理和生物学特性，联合应用能为子宫微生物组与生殖健康的研究提供更完整的图景。这一发现为今后子宫微生物组研究的方法选择和多组学整合提供了重要参考，有助于深入理解微生物组在子宫内膜容受性、妊娠维持等过程中的作用，为生殖疾病的诊断和治疗开辟新方向。
