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蛋白瓜氨酸化与类风湿关节炎、神经退行性疾病及癌症等相关，其由 PAD 家族酶催化。研究人员针对 PAD1-4 的变构结合口袋开展研究，通过虚拟筛选等发现新型抑制剂，可稳定无催化活性构象，抑制多酶并在中性粒细胞中效果更广泛，为相关疾病治疗提供新方向。
在生命科学与医学领域，蛋白翻译后修饰的调控机制一直是研究热点。蛋白瓜氨酸化（Protein Citrullination）作为一种特殊的翻译后修饰，是指精氨酸残基在肽基精氨酸脱亚氨酶（Peptidylarginine Deiminases，PADs）的催化下转化为瓜氨酸的过程。这一过程依赖钙离子（Ca2?），且与多种重大疾病密切相关。目前已知，PAD 家族包括 PAD1-4 和 PAD6，其中 PAD1-4 具有催化活性，而 PAD6 被认为无酶活性。异常的蛋白瓜氨酸化水平与类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症）以及癌症的发生发展紧密相连。例如，在类风湿关节炎中，中性粒细胞发生 NETosis（一种程序性细胞死亡，释放中性粒细胞胞外陷阱 NETs）时，瓜氨酸化蛋白和 PAD 酶会释放到关节滑膜等组织，引发炎症反应，且抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPAs）是 RA 进展的诊断指标之一。然而，针对 PAD 家族的抑制剂研发仍存在挑战，现有抑制剂多为共价底物类似物，选择性有限，且缺乏对 PAD1-4 的广谱抑制手段。
为了突破这一困境，来自辉瑞公司（Pfizer Inc.）的研究人员开展了相关研究，旨在寻找一种能高效抑制 PAD1-4 的非共价变构抑制剂，为相关疾病的治疗提供新策略。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为 PAD 家族抑制剂的开发和疾病治疗带来了新的希望。
研究人员采用了多种关键技术方法：首先利用基于配体的虚拟筛选（Ligand-based Virtual Screen），从辉瑞化合物库中筛选潜在抑制剂；通过表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技术验证靶点结合特性；运用共晶体结构分析（Co-crystal Structure Analysis）揭示配体与酶的结合模式；借助荧光淬灭（Fluorescence Quenching，FQ） assay、谷氨酸脱氢酶（Glutamate Dehydrogenase，GDH）酶偶联 assay 等评估抑制剂的酶活性抑制效果；利用热位移分析（Thermal Shift Assay）和中性粒细胞实验验证抑制剂的细胞水平作用。此外，研究中使用的人源中性粒细胞样本来自健康成人 donors，符合伦理规范。
PAD4 抑制剂的虚拟筛选与结合特性
研究人员以 PAD4 选择性配体 GSK147 为种子分子，通过二维指纹数据融合方法对辉瑞化合物库（430 万化合物）进行虚拟筛选，筛选出的前 1250 个化合物经荧光检测氨释放实验初筛，发现 PAD-PF1 对 PAD4 介导的 BAEE 脱亚胺反应有抑制作用（56% 抑制率）。进一步的 FQ 实验显示，PAD-PF1 在 0.4 mM Ca2?条件下对 PAD4 的 IC??为 15.9 μM。SPR 实验表明，PAD-PF1 与 PAD4 的结合亲和力 KD 为 2.82 μM，但与 GSK147 无竞争结合，提示其结合位点不同。
变构结合位点的结构解析
通过解析 PAD4、PAD-PF1 和 GSK147 的三元复合物晶体结构（分辨率 2.41 ?），发现 PAD-PF1 结合于 PAD4 的 IG2 结构域（免疫球蛋白结构域 2）与催化结构域（Catalytic Domain，CD）界面的变构口袋，而非 GSK147 所在的活性位点附近。其溴苯基插入 Phe368、Phe407 和 Leu447 等疏水残基之间，吡咯并嘧啶环与 Phe450 堆叠，并通过氢键与 IG2 结构域的 Leu254、Phe256 等相互作用。该结合导致酶构象稳定在无催化活性的钙离子缺失状态，且与 GSK147 可同时结合，两者联用对 PAD4 酶功能具有协同抑制作用。
广谱抑制剂 PAD-PF2 的优化与特性
基于 PAD-PF1 的结合模式，研究人员通过结构引导的迭代设计，将吡咯并嘧啶环替换为异喹啉环，引入 3,5 - 二氯吡啶基团，开发出高效抑制剂 PAD-PF2。其对 PAD4 的 IC??低至 42.7 nM，且对映体 ent-PAD-PF2 活性显著降低（IC??=26.0 μM），表明立体结构对活性至关重要。由于 PAD1-4 在变构口袋周围氨基酸序列高度同源，PAD-PF2 对 PAD1-3 亦有强效抑制作用，在 0.25 mM Ca2?条件下，对 PAD1、PAD2、PAD3、PAD4 的 IC??分别为 109 nM、28.5 nM、106 nM、24.0 nM。钙浓度依赖性实验显示，当 Ca2?浓度升高至 1.5 mM 时，PAD-PF2 对 PAD2 和 PAD4 的 IC??分别升高 111 倍和 35 倍，表明其抑制机制与干扰钙离子结合相关。
中性粒细胞中的抑制效果
在人源分离中性粒细胞实验中，离子霉素刺激可诱导蛋白瓜氨酸化，PAD-PF2 对瓜氨酸化组蛋白 H3（citH3）的抑制 IC??为 1.0 μM，与 GSK147（1.1 μM）相当，但对广谱瓜氨酸化蛋白（F95 抗体检测）的抑制更为完全（IC??=1.5 μM），而 GSK147 仅能部分抑制（39%）。Western blot 分析显示，PAD-PF2 可抑制更多蛋白的瓜氨酸化，证实其因抑制多种 PAD 同工酶而具有更广泛的底物覆盖范围。
结合模式与抑制机制
PAD-PF2 与 PAD2 和 PAD4 的共晶体结构（分辨率分别为 1.77 ? 和 2.44 ?）显示，其异喹啉环与对应疏水残基（如 PAD4 的 Phe368、Phe450，PAD2 的 Leu369、Phe450）形成广泛疏水相互作用，二氯吡啶基团与 Pro372 接近，可能干扰 Ca2?结合位点（如 Ca2 位点）的形成。在 PAD2 结构中，结合 PAD-PF2 后，Arg347 “封闭” 底物结合口袋，Cys647 偏离活性位点，且 Ca2 结合所需的 Asp370、Glu352 等残基构象改变，导致钙离子无法结合，酶处于无活性状态。这一机制与 GSK147 虽结合不同位点但均诱导无活性构象的现象一致。
研究结论与意义
本研究首次揭示了 PAD1-4 共有的变构结合口袋，开发出非共价、广谱的 PAD1-4 抑制剂 PAD-PF2。其通过稳定钙离子缺失的无活性构象，实现对多种 PAD 同工酶的高效抑制，且在中性粒细胞中表现出比 PAD4 选择性抑制剂更广泛的瓜氨酸化抑制效果。这一成果不仅为深入研究蛋白瓜氨酸化的生理病理作用提供了有力工具，也为类风湿关节炎、神经退行性疾病和癌症等与 PAD 相关疾病的治疗开辟了新方向。未来，基于该变构位点的抑制剂优化有望进一步提高选择性和疗效，为临床转化奠定基础。
