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冷冻电镜（cryo-EM）解析 RNA 结构时，单一结构模型难以表征 RNA 动态异质性。本研究结合分子动力学（MD）与 cryo-EM 密度图，利用贝叶斯方法元推断（metainference）重构 II 型内含子核酶构象集合，发现 2.5-4? 分辨率范围内多数 cryo-EM RNA 结构存在建模误差，为 RNA 结构解析提供新方法。
冷冻电镜（cryo-EM）技术的问世，让科学家得以窥见生物大分子的精细结构，然而这一 “高清相机” 在面对动态变化的 RNA 分子时却遇到了瓶颈。RNA 作为兼具遗传信息传递和催化功能的生物大分子，其功能高度依赖三维结构，尤其是在催化反应或与蛋白质、小分子相互作用时。传统 cryo-EM 数据处理通常将数百万张单颗粒图像浓缩为单一结构模型，这种 “以一概全” 的方式在处理像 RNA 这样具有高度灵活性的分子时，极易导致结构误判。例如，当 cryo-EM 密度图由多种构象状态混合而成时，单一结构拟合可能产生非生物学相关的模型或结构伪影，这在无序蛋白、多结构域蛋白及 RNA 系统中尤为突出。
为突破这一困境，来自意大利国际高等研究学院（SISSA）等机构的研究人员开展了一项针对 RNA 动态结构解析的创新研究。他们以嗜热聚球藻的 II 型内含子核酶（约 800 个核苷酸的 RNA 大分子，具有自剪接催化功能，是剪接体的进化祖先）为模型，结合分子动力学模拟与 cryo-EM 密度图，开发出一种基于贝叶斯框架的元推断（metainference）方法，旨在重构更贴合实验数据的构象集合，揭示单一结构方法在模拟柔性区域时的不足。相关研究成果发表在《Nature Communications》。
研究主要采用以下关键技术方法：首先利用 DeepFoldRNA 补全 II 型内含子核酶结构中的核苷酸缺口，通过分子动力学模拟在显式溶剂中对错误配对的螺旋进行重构，采用 ERMSD 指标评估碱基配对质量；随后运用 cryo-EM 引导的元推断模拟，通过多副本（8、16、32、64 个副本）分子动力学模拟生成构象集合，结合混合能量函数强制模型与实验密度图一致；最后通过回算密度图、计算互相关系数（CCmask）及分析螺旋区域稳定性，验证构象集合的可靠性。
结果分析
模型构建与螺旋重构
通过视觉 inspection 和系统分析，发现已解析的 II 型内含子核酶结构（PDB 代码：6ME0）存在 6 个应形成但未正确折叠的螺旋。利用分子动力学模拟对这些螺旋施加约束，强制其形成理想双链结构，最终使 ERMSD 值低于 0.3，验证了螺旋重构的有效性。
构象集合优化
单副本优化时，未加约束的螺旋迅速解折叠，表明单一结构假设下正确折叠的螺旋与实验密度图不兼容。多副本元推断模拟显示，至少 8 个副本才能满足实验约束，随着副本数增加，CCmask值显著提升，32 副本时达到平衡，既保证与实验数据的一致性，又兼顾计算成本。代表性结构显示，核酶的可塑性主要体现在溶剂暴露的茎环区域，而催化核心区域结构刚性较强，与实验密度图吻合良好。
螺旋稳定性与构象异质性
对 9 个螺旋的 ERMSD 分析表明，部分螺旋在模拟中呈现高度动态行为。例如，螺旋 B 在模拟中既有折叠态也有解折叠态，螺旋 F 则始终未折叠。通过引导模拟和控制实验（不同力场、离子类型）验证，螺旋稳定性结果不受模拟条件影响，且长时程模拟（2 微秒）显示多数螺旋在生理时间尺度上稳定，仅少数螺旋存在亚稳态转变。
PDB 全库分析
对 1395 个分辨率 < 6? 的 RNA 相关 cryo-EM 结构分析发现，65% 的结构存在至少 2% 的核苷酸错配，11% 存在≥5% 错配，且 2.5-4? 分辨率范围的结构普遍存在柔性螺旋建模误差。这表明单一结构假设导致的 RNA 建模问题具有普遍性，亟需更先进的解析方法。
结论与讨论
本研究首次将元推断方法应用于 RNA 大分子的 cryo-EM 结构优化，证明多副本分子动力学模拟能有效捕捉 RNA 的构象异质性，解决单一结构模型与动态分子不兼容的核心问题。研究发现，II 型内含子核酶的柔性区域建模误差源于构象混合，而催化核心因结构刚性可通过传统方法准确解析。此外，全库分析揭示 RNA 结构建模误差的普遍性，提示现有 cryo-EM 数据库中大量 RNA 结构需重新评估。
该方法不仅为 RNA 结构解析提供了新范式 —— 通过结合物理建模、先验知识与实验数据生成构象集合，更有望推广至其他动态生物大分子体系。随着 AI 预测模型（如 AlphaFold3）在结构生物学领域的渗透，将元推断等模拟方法与深度学习结合，或可构建更精准的动态结构预测框架，为 RNA 功能机制研究、基因编辑工具开发及药物设计提供更可靠的结构基础。未来，进一步整合 cryo-EM 图像直接分析的重加权方法，或能进一步提升构象集合的准确性，推动结构生物学向动态化、精准化方向发展。
