新冠病毒木瓜样蛋白酶（PLpro）天然耐药突变的鉴定及其对新型抑制剂设计的启示

为应对 SARS-CoV-2 抗病毒药物耐药性挑战，研究人员针对其木瓜样蛋白酶（PLpro）开展研究，鉴定出 E167G、Q269H 等耐药突变，发现其通过削弱氢键和 π-π 堆积作用耐药，为开发下一代 PLpro抑制剂提供关键靶点，成果具重要临床指导意义。

　　

论文解读

研究背景与意义

新冠疫情虽趋缓，但 SARS-CoV-2 仍在人群和动物中持续传播，其高突变率给抗病毒治疗带来严峻挑战。目前获批的 RdRp 抑制剂（如瑞德西韦、莫努匹韦）和主蛋白酶（M^pro）抑制剂（如奈玛特韦、ensitrelvir）已出现耐药突变报道，开发具有新型作用机制的抗病毒药物迫在眉睫。木瓜样蛋白酶（PL^pro）作为病毒编码的半胱氨酸蛋白酶，不仅参与病毒多聚蛋白加工，还通过去泛素化和去 ISG 化功能逃避免疫监视，是极具潜力的治疗靶点。然而，PL^pro独特的底物识别模式（特异性切割连续甘氨酸序列）和缺乏典型结合口袋的结构特点，使其抑制剂开发难度显著高于 M^pro。

在此背景下，美国罗格斯大学（Rutgers, the State University of New Jersey）和俄克拉荷马州立大学（Oklahoma State University）等机构的研究人员，针对新型 PL^pro抑制剂 Jun12682 和 PF-07957472 的耐药机制展开研究，旨在揭示病毒耐药的分子基础，为下一代抑制剂设计提供理论依据。该研究成果发表于《Nature Communications》，对新冠抗病毒药物研发具有重要战略意义。

关键技术方法

研究综合运用多学科技术手段：

1. 结构生物学与生物信息学：基于 PL^pro与 Jun12682 的共晶结构（PDB: 8UOB），分析药物结合位点关键残基（如 E167、Y268、Q269 等），并通过 GISAID 数据库筛选高频自然突变。
2. 生物化学与酶学分析：表达纯化 PL^pro野生型及突变体蛋白，利用荧光共振能量转移（FRET）底物测定酶活性（k_cat/K_m）和药物抑制常数（K_i），结合差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白稳定性与药物结合能力。
3. 病毒传代与功能验证：在 Vero-AT 细胞中进行 SARS-CoV-2（USA-WA1 株）的连续传代实验，通过逐步增加 Jun12682 浓度筛选耐药病毒，结合全基因组测序和重组病毒构建（如 rE167G、rQ269H 等）验证突变的生理相关性。
4. 分子模拟与自由能计算：利用分子动力学（MD）模拟和热力学积分（TI）结合多态 Bennett 接受率（MBAR）方法，分析突变对药物 - 蛋白相互作用的影响，计算相对结合自由能（ΔΔG_b）。

研究结果

1. PL^pro药物结合位点自然突变的鉴定

通过结构分析，聚焦 Jun12682 结合位点的 8 个关键残基（M208、P247、P248、Y264、Y268、Q269、D164、E167），表达 34 种突变体。结果显示：

• D164、P248、Y264 突变：显著降低酶活性（k_cat/K_m＜10% WT），如 D164G 的 K_i增加超 100 倍，但因酶功能受损难以在病毒中传播。
• M208、P247 突变：酶活性与野生型相当（k_cat/K_m为 40%-136% WT），但耐药性轻微（K_i增加≤4.3 倍），不构成主要耐药威胁。
• E167、Y268、Q269 突变：鉴定出 8 种高耐药突变（如 E167G/K/A/S/V、Y268H/N、Q269H），酶活性保留（k_cat/K_m＞10% WT），K_i增加＞10 倍，其中 E167G 和 Q269H 在病毒传代中高频出现。

2. 病毒传代实验验证耐药突变的生理相关性

在 Jun12682 压力下传代 12 次后，病毒迅速进化出 Q269H 突变（P4 出现，P6 成为优势突变），部分谱系伴随 E167G 或 T168I 等次级突变。重组病毒实验表明，单突变 rQ269H 对 Jun12682 的 EC₅₀增加 11.2 倍，双突变 rE167G/Q269H 的 EC₅₀＞30 μM，显示协同耐药效应。竞争实验证实，E167G 和 Q269H 突变病毒在药物存在下具有显著适应性优势。

3. 耐药机制的分子动力学解析

MD 模拟显示，野生型 PL^pro与 Jun12682 通过 E167 的静电作用、Y268 的 π-π 堆积及 Q269 的氢键稳定结合。突变后：

• E167G：缺失与药物的静电相互作用，氢键数量减少，ΔΔG_b为 2.09 kcal/mol，耐药性显著。
• Y268H：苯环被组氨酸取代，破坏 π-π 堆积，ΔΔG_b为 2.07 kcal/mol，导致交叉耐药（对 GRL0617、PF-07957472 均耐药）。
• Q269H：谷氨酰胺被组氨酸替代，氢键强度减弱，ΔΔG_b为 1.70 kcal/mol，单突变即可导致耐药。
  双突变 E167G/Q269H 完全破坏直接氢键，仅通过水分子间接作用，ΔΔG_b达 9.90 kcal/mol，耐药性最强。

结论与讨论

本研究通过结构预测、病毒传代和分子模拟多维度揭示了 SARS-CoV-2 PL^pro的耐药机制，明确 E167、Y268、Q269 为结合 BL2 环和凹槽区域抑制剂（如 Jun12682、PF-07957472）的耐药热点。这些突变通过削弱氢键和 π-π 堆积作用降低药物亲和力，且部分突变（如 Q269H）在病毒群体中可快速固定并导致显著耐药。研究结果为临床监测耐药毒株提供了分子标志物，并提示下一代 PL^pro抑制剂设计需规避这些位点或增强多重相互作用以提高遗传屏障。

值得注意的是，PL^pro的去泛素化功能突变对病毒免疫逃逸的影响尚未完全阐明，且冠状病毒间 PL^pro序列保守性较低，限制了现有结论对其他冠状病毒的普适性。未来需进一步探索广谱抑制剂设计策略，结合结构优化和动态模拟，开发兼具高亲和力与抗耐药性的新型抗病毒药物。