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该综述聚焦免疫细胞化学（ICC）和免疫组织化学（IHC）技术局限，探讨核仁等致密细胞结构因抗体可及性受限导致的周边染色问题，分析阻碍抗体进入体细胞内核仁及卵母细胞内核仁样体内部的因素，及突破该局限的方法。
免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）与免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）是细胞和组织内蛋白质定位与定量的常用重要方法，但存在诸多局限且仍在改进中。其中一个显著问题是，核仁等某些致密细胞内结构对特异性抗体的可及性受限，这使得即便抗原在核仁内分布相对均匀，也会出现核仁的周边染色现象。
本综述旨在阐明阻碍抗体进入体细胞内核仁以及卵母细胞内核仁样体（nucleolus-like bodies）内部区域的因素，并探索规避这一局限的方法。
核仁作为细胞核内的重要结构，其高度致密的组成和复杂的三维结构可能是导致抗体难以穿透的关键因素之一。核仁由核糖体 DNA（rDNA）、核糖体蛋白、RNA 聚合酶以及多种辅助因子等组成，形成了紧密的纤维中心（fibrillar centers, FC）、致密纤维组分（dense fibrillar component, DFC）和颗粒组分（granular component, GC）等亚结构。这种致密的结构可能物理性地阻碍抗体分子向核仁内部扩散，导致抗体只能与核仁表面的抗原结合，从而产生周边染色的假象。
在卵母细胞中，核仁样体具有类似核仁的功能和结构特点，其抗体可及性问题可能与体细胞内核仁类似，但也可能受到卵母细胞特异性微环境的影响。卵母细胞内丰富的细胞质成分、独特的细胞骨架分布以及特定的分子相互作用网络，可能进一步影响抗体向核仁样体内部的渗透。
为解决抗体可及性受限的问题，研究者们尝试了多种方法。物理方法方面，采用温和的细胞透化处理，如使用低浓度的去污剂（如 Triton X-100）或乙醇，在保持细胞结构完整性的同时，增加细胞膜和核膜的通透性，使抗体能够更有效地进入细胞内结构。酶处理法，如应用蛋白酶 K 或透明质酸酶，可降解细胞外基质或细胞表面及内部的某些阻碍性成分，改善抗体的扩散路径。
化学修饰方法中，抗体的片段化（如使用 Fab 片段或单链抗体）因其分子量较小，可能更易穿透致密结构。此外，通过化学交联剂增强抗原与抗体的结合能力，或使用免疫金银染色等放大技术，可在一定程度上提高检测的灵敏度，即使抗体仅结合于结构表面，也能通过信号放大呈现更明显的标记效果。
在样本制备环节，优化包埋和切片技术至关重要。选择合适的包埋介质（如 OCT compound）和切片厚度，可减少组织处理过程中细胞结构的变形，保持核仁等结构的自然状态，从而有利于抗体与抗原的充分接触。对于细胞样本，采用悬浮固定或离心涂片的方法，使细胞均匀分布，避免细胞重叠导致的抗体渗透不均。
近年来，新兴的成像技术也为解决这一问题提供了新途径。激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy, LSCM）结合光学切片技术，可对细胞内结构进行三维成像，通过多层扫描和图像重建，能够更准确地定位抗原在核仁内部的分布，减少周边染色对结果判读的干扰。超分辨率显微镜（super-resolution microscopy）突破了传统光学显微镜的衍射极限，可实现纳米级分辨率的成像，清晰显示核仁内部抗原的细微分布特征，为深入研究抗体可及性问题提供了更精准的工具。
尽管上述方法在一定程度上改善了抗体对核仁等致密结构的可及性，但每种方法都有其适用范围和局限性。例如，过度的透化处理可能导致细胞内抗原的丢失或结构破坏，酶处理可能非特异性地降解抗原或改变其空间构象，影响抗体识别。因此，在实际应用中，需根据具体的实验目的、样本类型和抗原特性，选择合适的方法或联合多种技术，以获得更准确、可靠的实验结果。
深入研究抗体可及性受限的机制并开发更有效的解决方案，对于提高免疫细胞化学和免疫组织化学技术的准确性和应用范围具有重要意义，将有助于推动细胞生物学、分子生物学和医学研究中对蛋白质空间分布和功能的深入理解。
