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该综述聚焦癌症纳米治疗领域，系统梳理了从传统二维（2D）单层培养到三维（3D）肿瘤球体、类器官、芯片肿瘤（ToC）等先进体外模型的演变，详述细胞摄取机制、细胞毒性（MTT、WST-1/WST-8 等）、细胞死亡机制（凋亡、坏死、自噬）等评估方法，为优化纳米载体设计提供全面参考。
癌症治疗纳米载体体外评估模型与方法研究进展
癌症治疗面临选择性差、全身毒性及肿瘤细胞适应性耐药等挑战，纳米医学通过纳米载体的靶向递送、增强渗透滞留（EPR）效应及表面修饰等特性，展现出提升疗效、降低副作用的潜力。然而，其临床转化受限于现有预测模型的不足，传统二维（2D）体外模型难以模拟肿瘤微环境（TME）复杂性，导致临床前与临床结果差异显著。近年来，三维（3D）肿瘤模型的发展为解决这一问题提供了新方向。
体外模型的演进与特点
二维（2D）单层培养模型
作为传统模型，2D 单层培养因操作简单、成本低，常用于初步筛选纳米载体的细胞毒性，如通过 MTT、LDH 等 assays 评估纳米材料对细胞代谢和膜完整性的影响。但其缺乏 TME 的异质性和三维结构，无法模拟肿瘤细胞间相互作用及细胞外基质（ECM）影响，常高估治疗效果。例如，HepG2 细胞在 2D 培养中 CYP450 酶表达显著低于 3D 模型，显示功能差异。
三维（3D）肿瘤球体模型
- 单细胞系球体：通过低附着培养、悬滴法等形成，模拟肿瘤的增殖区、静止区和坏死核心结构，能更真实反映药物渗透与耐药性。例如，4T1 乳腺癌细胞在 3D 球体中 Abgc2（耐药相关转运蛋白）表达升高，Bax（促凋亡蛋白）表达降低，呈现更强耐药表型。小尺寸纳米颗粒（如 30-50 nm）在球体中穿透更深，表面电荷和 ECM 相互作用影响扩散效率。
- 异质性球体：引入成纤维细胞、免疫细胞等，更接近真实 TME。例如，MDA-MB-231 乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养的球体中，胶原沉积增加导致纳米颗粒渗透受阻，化疗药物敏感性下降，提示基质成分对治疗效果的关键影响。
类器官（Organoid）模型
源自患者肿瘤组织的类器官（肿瘤类器官）保留遗传异质性和 TME 成分，包括癌细胞、成纤维细胞及免疫细胞，是精准医学的重要工具。例如，结直肠癌类器官模型显示，SW480 细胞对阿霉素纳米簇的敏感性低于类器官，体现 3D 结构对药物响应的影响。此外，类器官结合 CRISPR-Cas9 技术，可模拟肿瘤基因多样性，用于机制研究。
芯片肿瘤（ToC）模型
整合微流控技术，模拟血流、氧梯度及机械力等动态生理条件。例如，胶质母细胞瘤 ToC 模型中，叶酸修饰的纳米颗粒在可控流场中富集于肿瘤细胞，实时成像显示其穿透深度和细胞毒性优于传统模型。该模型还可模拟转移过程，如肝癌 - 骨转移芯片揭示纳米药物对跨器官转移的抑制作用。
纳米载体评估的关键方法
细胞摄取与穿透机制
纳米颗粒的摄取依赖尺寸、电荷及表面修饰，通过网格蛋白介导内吞、巨胞饮等途径进入细胞。荧光标记结合流式细胞术或共聚焦显微镜是常用手段，如 Transferrin 修饰的纳米颗粒在 U87 胶质母细胞瘤细胞中摄取效率提升 40%。在 3D 模型中，需通过酸洗去除表面吸附颗粒，结合光片显微镜区分内化与吸附。
细胞毒性与生存评估
- 代谢活性检测：MTT、WST-1 等试剂通过检测线粒体活性评估存活，但在 3D 模型中需延长孵育时间以确保渗透。例如，WST-1 在 650 μm 直径球体中需 4 小时孵育，结合图像分析筛选均一球体以减少误差。
- 克隆形成实验：作为金标准，可评估长期存活能力。在 FaDu 喉癌细胞球体中，高浓度纳米颗粒仅在结构松散的球体中诱导克隆抑制，显示模型结构对结果的影响。
细胞死亡机制分析
凋亡、坏死和自噬的检测依赖形态学与分子标记。Annexin V/PI 双染结合流式细胞术区分早期凋亡与坏死，如紫杉醇纳米颗粒通过激活 caspase-3 诱导凋亡。自噬相关蛋白 LC3-II 和 Beclin-1 的 Western blot 检测可反映自噬活性，其在银纳米颗粒诱导的氧化应激中表达上调。
信号通路与基因表达
- 转录组分析：RNA-seq 和 qRT-PCR 揭示纳米载体对关键通路的影响。例如，脂质纳米颗粒递送 miR-634 可下调抗凋亡基因 Bcl-2，上调 p53 和 Bax，诱导胰腺癌细胞凋亡。
- 蛋白质组分析：质谱技术鉴定氧化应激相关蛋白，如银纳米颗粒处理后 HSP90、细胞色素 C 表达变化，提示线粒体损伤机制。
氧化应激与迁移侵袭评估
活性氧（ROS）检测通过 DCFH-DA 荧光探针，如肉桂醛纳米颗粒在 MDA-MB-231 细胞中诱导 ROS 升高，伴随线粒体膜电位下降。划痕实验和 Transwell 模型显示，靶向纳米颗粒可抑制 4T1 细胞迁移达 80%，其效果与抑制上皮 - 间质转化（EMT）相关。
挑战与未来方向
现有模型仍存在局限：2D 模型预测性不足，3D 模型面临标准化与高通量瓶颈，类器官培养成本高且依赖组织来源。未来需整合多组学（如单细胞测序）与人工智能，优化模型的可重复性和临床相关性。同时，微流控技术与生物打印的结合将推动更复杂 TME 模型的发展，加速纳米药物从 bench 到 bedside 的转化。
总之，从 2D 到 3D 模型的演进标志着癌症纳米医学研究向生理相关性的迈进，综合运用多模型与多技术，将为开发高效低毒的纳米治疗策略提供坚实基础。
