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犬呼吸道冠状病毒（CRCoV）是犬传染性呼吸道疾病复合体（CIRDC）的主要病原，现有检测方法存在灵敏度不足等问题。本研究开发纳米板逆转录数字 PCR（RT-dPCR）技术，其灵敏度较 RT-qPCR 高 100 倍，在 rectal swabs 等样本中检测率显著提升，为 CRCoV 精准诊断提供新工具。
犬呼吸道冠状病毒（Canine Respiratory Coronavirus, CRCoV）作为犬传染性呼吸道疾病复合体（Canine Infectious respiratory disease complex, CIRDC）的核心病原，长期以来因其隐蔽传播性和临床症状非特异性，给犬类健康监测带来挑战。传统检测手段如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）仅能定性分析，而逆转录定量 PCR（RT-qPCR）虽可定量却受标准曲线和样本背景干扰，尤其在低病毒载量或复杂样本（如 rectal swabs）中易漏检。随着犬群密集饲养环境增多（如动物收容所、宠物医院），CRCoV 在全球范围内的流行态势加剧，开发兼具高灵敏度与抗干扰能力的检测技术成为当务之急。
为破解这一难题，泰国朱拉隆功大学（Chulalongkorn University）兽医学院的研究团队开展了一项创新性研究。他们聚焦 CRCoV 的刺突蛋白基因（spike gene），开发了基于纳米板平台的逆转录数字 PCR（Reverse Transcription Digital PCR, RT-dPCR）检测方法，并在多种临床样本中验证其性能。研究成果发表于《BMC Veterinary Research》，为 CRCoV 的精准检测提供了关键技术突破。
关键技术方法
研究采用纳米板 RT-dPCR 技术，其原理是通过将反应体系分割至 26,000 个微反应单元，利用泊松分布实现病毒核酸绝对定量，无需依赖标准曲线。研究人员同步优化了 RT-qPCR 条件（退火温度 53℃，引物 / 探针浓度 0.3/0.15 μM），并将其迁移至 RT-dPCR 平台。实验使用 162 份临床样本（包括 nasal swabs、oropharyngeal swabs、rectal swabs），覆盖健康犬与呼吸道症状犬，通过对比两种技术的检测率、灵敏度和特异性，系统评估 RT-dPCR 的应用价值。
研究结果
1. 分析性能验证
RT-dPCR 的检测限（Limit of Detection, LOD）低至 1.83 copies/μL，较 RT-qPCR（1.83×102 copies/μL）灵敏度提升 100 倍。两者均展现良好重复性（RT-qPCR 批内变异系数 < 2.25%，RT-dPCR 批内 < 6%）和特异性，与犬瘟热病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）等常见病原无交叉反应。
2. 临床样本验证
在 162 份临床样本中，RT-dPCR 的总体阳性率显著高于 RT-qPCR：nasal swabs（66.67% vs 50%）、oropharyngeal swabs（62.96% vs 42.59%）、rectal swabs（53.70% vs 22.22%）。尤其在 rectal swabs 中，RT-dPCR 检测率提升超 30%，提示其对低载量样本的检测优势。统计显示，RT-dPCR 在 oropharyngeal swabs 和 rectal swabs 中的阳性率差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. 检测范围与互补性
RT-qPCR 检测动态范围更广（3.65×10?至 1.83×102 copies/μL），适合高病毒载量样本的初筛；RT-dPCR 则在低载量区间（3.65×10?至 1.83 copies/μL）表现优异，但对 > 3.65×10? copies/μL 样本存在 “过载” 现象，无法精准定量。两者形成技术互补，覆盖不同检测场景。
结论与讨论
本研究首次建立纳米板 RT-dPCR 检测 CRCoV 的方法，证实其在低病毒载量、复杂背景样本中的卓越性能，尤其为 rectal swabs 等传统难检样本提供了可靠方案。研究发现 CRCoV 在粪便中的检出（rectal swabs 阳性率 53.7%），提示病毒可能存在胃肠道传播路径，这对 CRCoV 的传播机制研究具有重要启示。
尽管 RT-dPCR 在定量变异系数和检测范围上存在局限，但其无需标准曲线的绝对定量特性，使其在疫苗研发、抗病毒药物疗效评估等场景中具有独特价值。与 RT-qPCR 联合使用，可构建 “初筛 - 精确定量” 的完整检测体系，提升 CIRDC 的综合防控能力。该研究为全球犬类呼吸道疾病监测提供了关键工具，也为其他动物冠状病毒的检测技术开发提供了方法论参考。未来研究可进一步扩大样本量，探索病毒载量与临床症状的关联，完善 CRCoV 的致病机制认知。
