扩展免疫荧光技术(ExIF)：基于深度学习的虚拟标记实现标准4重荧光成像数据的高通量整合分析

研究人员针对标准免疫荧光(IF)成像仅能捕获约4种分子标记(4-plex)的限制，开发了扩展免疫荧光(ExIF)框架。该研究通过生成式深度学习虚拟标记技术，将精心设计但易于制备的4-plex免疫荧光面板整合为理论上标记数量不受限的统一数据集。在EMT模型验证中，ExIF显著提升了细胞表型分类、异质性流形学习和分子标记动态伪时序推断等下游分析性能，使常规4-plex IF达到接近多重标记方法的分析效能，为复杂细胞生物学研究提供了可及性解决方案。

　　

在生命科学研究中，荧光显微成像技术因其卓越的空间分辨率而备受青睐，但长期以来存在一个令人困扰的瓶颈问题：常规免疫荧光(Immunofluorescence, IF)每次实验仅能同时检测约4种分子标记(4-plex)。这种技术限制严重制约了研究人员对复杂细胞生物学过程的解析能力，特别是在研究诸如上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)这类涉及多分子协同变化的生物学过程时。虽然近年来已发展出多种高plexity的荧光成像技术，如循环免疫荧光(Cyclic IF)和迭代间接免疫荧光(4i)，但这些方法需要特殊设备或复杂操作流程，在大多数实验室难以普及应用。

针对这一技术瓶颈，由澳大利亚新南威尔士大学John G. Lock领衔的研究团队在《Nature Communications》发表了一项创新性研究。研究人员受多组学数据整合方法的启发，开发了名为"扩展免疫荧光"(Extensible Immunofluorescence, ExIF)的新型框架。该技术巧妙地将常规4-plex IF数据通过深度学习虚拟标记进行整合，实现了理论上不受限的分子标记数量检测，为复杂细胞生物学研究提供了既保持常规IF操作简便性，又能获得接近多重标记方法分析性能的创新解决方案。

研究团队采用了多项关键技术方法：首先设计"可扩展标记"实验方案，每个4-plex面板包含3个固定"锚定通道"(如DNA、F-肌动蛋白和β-连环蛋白)和1个可变标记；使用Nikon共聚焦显微镜获取高质量图像数据；开发基于残差视觉转换器(ResViT)的深度学习模型进行虚拟标记预测；通过CellProfiler进行单细胞特征提取；采用支持向量机(SVM)分类和PHATE流形学习等算法进行下游分析。研究特别设计了A549肺癌细胞EMT模型作为验证系统，比较了对照、EGF和TGF-β1处理条件下的细胞反应。

研究结果部分，"单细胞整合通过虚拟标记实现"表明，ExIF通过多通道输入显著提高了虚拟标记的保真度。与仅使用DIC图像输入相比，增加荧光通道作为输入可使结构相似性指数(SSIM)和像素Pearson相关系数(Pixel-PCC)显著提高。研究测试了三种深度学习架构(ResViT、U-Net和cGAN)，证明ExIF框架具有模型无关性。在8-plex实验数据集中，使用DIC加7个荧光通道预测第8个标记时，虚拟图像质量指标进一步提升。

"应用扩展免疫荧光研究上皮-间质细胞状态可塑性"部分展示了ExIF在EMT研究中的实际应用。研究人员设计了8种4-plex IF面板，每种包含3个固定标记(DNA、F-Actin、β-Catenin)和1个EM状态标记(如E-Cadherin、Vimentin等)。通过5折交叉验证显示，使用多通道输入的全ExIF方法在单细胞特征水平Pearson系数(Feature-PCC)达到0.7-0.9，特别是在细胞平均强度这一关键特征上表现优异。虚拟标记成功捕捉了EMT相关标记的表达变化趋势，如E-Cadherin下调、N-Cadherin上调等生物学预期模式。

"使用ExIF整合数据分类细胞处理条件"部分证明，ExIF显著提升了处理条件的分类准确性。全ExIF的分类F1-score达到0.85，优于标准4-plex IF的0.8。值得注意的是，仅使用3个固定标记(3GM)的分类性能(F1~0.75)远低于使用相同3个标记作为锚点进行ExIF整合后的结果(F1-0.84)，表明虚拟标记过程发掘了锚定通道中的潜在信息。混淆矩阵分析显示，ExIF特别改善了EGF和TGF-β1条件的区分能力。

"利用ExIF数据整合绘制EM状态异质性和标记动态"部分展示了ExIF在解析连续表型异质性方面的优势。PHATE流形分析显示，全ExIF数据集构建的流形能清晰区分三种处理条件，特别是辨别EGF和TGF-β1诱导的不同间质状态。伪时序分析揭示了符合EMT生物学预期的分子动态变化：上皮标记(E-Cadherin、EpCAM)表达逐渐降低，间质标记(N-Cadherin、Vimentin)表达升高，CD44亚型发生转换。这些趋势在标准IF数据构建的流形中无法清晰识别。

研究结论指出，ExIF创造性地将多组学整合概念引入显微成像领域，建立了一种特殊的"桥接整合"策略。与现有虚拟标记技术不同，ExIF不依赖实验多重标记数据进行预训练，而是通过精心设计的锚定通道实现单实验内的数据整合。在保持常规4-plex IF操作简便性的同时，ExIF使下游分析性能接近真实多重标记数据，为数千个常规使用标准IF的实验室提供了研究复杂多分子生物学过程的新工具。该技术特别适用于需要同时分析多个分子标记但无法采用复杂多重标记方案的研究场景，如临床样本分析、长期活细胞成像等。未来通过优化锚定标记选择和深度学习架构，ExIF有望在更多生物医学研究领域发挥重要作用。