人工转录因子的 “新开关” ：蛋白酶响应构象抑制系统

人工转录因子（ATF）在构建遗传电路中至关重要，但其活性调控仍有局限。为此，研究人员开发蛋白酶响应构象抑制系统（PRCIS），通过构象约束与蛋白酶切割调控 ATF 活性。结果显示其具高特异性与通用性，为合成生物学提供新范式。

　　

在生命科学领域，精准调控基因表达是解析细胞功能与构建人工生物系统的核心挑战。人工转录因子（Artificial Transcription Factors, ATFs）作为合成遗传电路的核心组件，虽已在肿瘤免疫治疗等场景展现潜力（如 synNotch 受体激活效应因子表达），但传统调控策略依赖膜锚定或结构域去除，存在背景信号高、正交性不足等问题。如何通过构象层面的精准设计，实现 ATF 活性的动态、特异性调控，成为制约其广泛应用的关键瓶颈。

为突破这一难题，湖南大学化学化工学院与湘雅医学院附属湘潭中心医院的研究团队开展了系统性研究。他们开发了一种蛋白酶响应构象抑制系统（Protease-Responsive Conformationally Inhibited System, PRCIS），通过将 ATF 的 DNA 结合域（DNA-Binding Domains, DBDs）与刚性二聚化结构域通过蛋白酶可切割肽段（Protease Cleavable Peptide, PCP）共价连接，使 ATF 在未受刺激时处于构象抑制状态，避免非特异性结合 DNA；当特定蛋白酶切割肽段后，DBDs 释放并恢复 DNA 结合能力，激活下游基因表达。该研究成果发表于《Nature Communications》，为合成生物学中基因表达的时空精准调控提供了全新解决方案。

研究采用的关键技术包括：

1. 蛋白质构象设计与优化：基于酵母 GAL4 转录因子结构，通过截短其 DBD 与二聚化结构域，引入 E5/K5 螺旋二聚肽与 split GFP β 链组装模块，构建构象约束模型。

2. 多组学与细胞功能验证：利用 CUT&Tag 技术分析 ATF-DNA 结合特异性，通过 ELISA、流式细胞术检测 IL-2 分泌、细胞焦亡等功能表型。

3. 正交系统构建：结合化学诱导二聚化（Chemical-Inducible Dimerization, CID）系统与多蛋白酶响应模块，开发三正交蛋白酶响应与双正交化学诱导平台。

研究结果

1. GAL4 衍生 PRCIS 的设计与优化

通过对比不同截短长度（如 GAL4_1-50、GAL4_1-70）与约束方式（分子内 / 间连接），发现双 PCP 锁定的 eGAL^+/+设计（GAL4_1-70融合 E5/K5 与 split GFP）表现最佳：背景荧光极低，经烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）切割后，报告基因 mCherry 荧光增强 396 倍。结构预测显示，eGAL^+/+的 DBDs 在未激活时呈 “上翻” 构象，完全脱离 DNA 结合位点，验证了构象抑制机制的有效性。

2. PRCIS 的化学诱导与内源性通路适配

将 PRCIS 与雷帕霉素（RAP）、脱落酸（ABA）诱导的 CID 系统结合，构建化学响应模块。例如，FRB-cTEVp 与 FKBP-nTEVp-eGAL^+/+在 RAP 刺激下，mCherry 荧光呈剂量依赖性增强（EC₅₀=6 nM，122 倍提升）。在 G 蛋白偶联受体（GPCR）通路中，PRCIS 通过招募 β-arrestin2-nTEVp-eGAL^+/+至 AVPR2-cTEVp，响应血管加压素刺激，荧光激活达 13.3 倍，显著优于传统 GAL4 系统。

3. PRCIS 的普适性与正交系统开发

PRCIS 可适配多种 ATF（如 GCN4、MAX、MAX/MYC）与蛋白酶（HCVp、PPVp、TVMVp）。例如，GCN4_226-258衍生的 eGCN^+/+对 TEVp 响应增强 96 倍，MAX_22-88衍生的 eMAX^+/+增强 55 倍。利用不同 ATF - 蛋白酶组合，成功构建三正交检测平台，可同时区分 TEVp、TVMVp、PPVp 信号，交叉反应极低。此外，基于 PRCIS 的 “OR”“AND”“INHIBIT” 逻辑门验证了其在复杂信号处理中的潜力。

4. 功能蛋白表达与疾病相关应用

通过 PRCIS 驱动分泌型 scFv（抗 CD3/CD28），可激活共培养的 Jurkat T 细胞分泌 IL-2；表达 gasdermin D（n-GSDMD）则诱导 MCF-7 细胞焦亡，LDH 释放率与凋亡细胞比例显著升高。在药物筛选模型中，PRCIS 监测 PPARγ/RXRα 异二聚化，对激动剂 GW1929（EC₅₀=0.1 μM）与拮抗剂 GW9662（IC₅₀=31 nM）均展现灵敏响应。

结论与意义

PRCIS 通过构象约束 - 蛋白酶切割的动态调控模式，突破了传统 ATF 依赖空间隔离或结构降解的局限，实现了 “低背景、高激活” 的基因表达控制。其核心创新在于：

1. 构象工程通用性：无需依赖特定 ATF 结构，可通过截短与二聚化模块适配多种转录因子（如 bZIP、HLH 家族）。

2. 多模态兼容性：可无缝整合蛋白酶、化学小分子等多重输入，构建正交性强、可扩展的遗传电路。

3. 生物医学应用潜力：在肿瘤微环境响应（如蛋白酶触发药物释放）、免疫细胞工程（精准调控细胞因子分泌）等领域具有转化价值。

该研究不仅为合成生物学提供了标准化的 ATF 调控工具，也为解析复杂疾病中的信号通路（如 GPCR 介导的生理过程）提供了新手段。未来，通过优化递送系统与内源性蛋白酶适配，PRCIS 有望在基因治疗、智能细胞疗法等前沿领域发挥关键作用。