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【编辑推荐】为探明双耳收缩畸形（BCE）机制，研究人员对 7 个中国 BCE 家系展开研究，发现染色体 4 上 HMX1 下游增强子簇（PI-HEC）拷贝数变异（CNV）致病。PI-HEC 通过协同调控 HMX1 表达影响耳发育，揭示哺乳动物耳形态发生的复杂调控网络。
耳朵，作为人类感知世界的重要器官，其发育过程蕴含着复杂的生物学奥秘。在发育生物学领域，哺乳动物胚胎发育过程中复杂的形态变化一直是研究的核心焦点，而耳朵的发育更是其中的典型代表。人类耳朵结构精细，起源于颅神经嵴细胞（CNCCs）和三个胚层，其发育过程涉及多种发育过程和进化适应的独特相互作用。外耳作为耳朵的重要组成部分，不仅承担着捕捉声波的关键功能，其形态多样性在进化及多种疾病中也有显著体现。然而，相较于中耳和内耳，外耳发育异常的分子机制却一直笼罩在神秘的面纱之下，尤其是双耳收缩畸形（Bilateral Constricted Ear, BCE），这种常表现为常染色体显性遗传的疾病，主要特征为外耳上部卷曲，涉及耳轮、舟状窝和对耳轮等结构的异常，其背后的致病机制长期未被明确阐明。
在这样的背景下，广州国家实验室、北京航空航天大学等国内研究机构的研究人员，针对这一科学难题展开了深入研究。他们的研究成果发表在国际知名期刊《Nature Communications》上，为揭示 BCE 的发病机制带来了重大突破。
研究人员首先对 7 个中国 BCE 家系进行了全面的遗传学分析。通过基因芯片和下一代测序技术，他们在染色体 4 上定位到一个名为 BCE 核心 locus 的关键区域，该区域包含三个协同作用的增强子，研究人员将其命名为位置身份层级增强子簇（Positional Identity Hierarchical Enhancer Cluster, PI-HEC）。为了深入探究这些增强子的功能，研究人员采用了多种关键技术方法。在样本层面，他们收集了家系成员的血液样本进行 DNA 提取和基因分型，并利用靶向捕获测序和全基因组测序对致病区域进行精细定位。在细胞模型方面，通过培养人类胚胎干细胞（hESCs）并诱导其分化为颅神经嵴细胞（hCNCCs），构建了研究增强子功能的体外平台。在动物模型构建上，运用 CRISPR/Cas9 技术创建了多种基因编辑小鼠模型，包括 mEC1 缺失和重复模型，以模拟人类 BCE 的遗传变异。此外，还借助启动子捕获 Hi-C（PCHi-C）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）等技术，从基因组相互作用、表观遗传调控和单细胞基因表达等多个维度解析增强子的作用机制。
拷贝数重复与 BCE 的关联
通过对家系的遗传分析，研究人员发现所有 BCE 患者均存在染色体 4 上 BCE 核心 locus 的拷贝数重复（拷贝数 = 3）。该区域位于 HMX1 基因下游的非编码区，通过 Hi-C 数据发现其与 HMX1 启动子存在相互作用，提示 HMX1 和 CPZ 可能是潜在的靶基因。这一发现首次明确了该非编码区域的拷贝数变异与 BCE 的直接关联。
增强子簇与 HMX1 启动子的相互作用
进一步研究发现，BCE 核心 locus 包含三个潜在的增强子 EC1、EC2 和 EC3。通过整合人类胚胎颅面组织和体外 hCNCCs 的表观基因组数据，证实这些增强子在特定细胞和发育阶段具有活性。PCHi-C 分析显示，增强子簇在 hCNCCs 中与 HMX1 启动子特异性相互作用，而在人类胚胎干细胞（hESCs）中则无此作用，表明其活性具有时空特异性和细胞类型特异性，且主要调控 HMX1 的表达，而非邻近基因 CPZ。
增强子的动态活性与协同调控
对 hCNCCs 分化过程中增强子活性的分析表明，不同增强子具有独特的活性模式。hEC1 在晚期 hCNCCs 和 PA 样 hCNCCs 中表现出强转录激活作用，是主要的增强子；hEC2 活性较弱，在早期 hCNCCs 阶段开始激活；hEC3 虽与 HMX1 启动子相互作用，但缺乏典型的活性组蛋白标记，可能作为结构元件促进增强子簇与启动子的接触。通过小鼠转基因实验发现，三个增强子通过协同作用精细调控 HMX1 在咽弓 2（PA2）区域的时空表达，其中 hEC1 主导转录输出，hEC2 和 hEC3 提供补充的位置信息，共同构成 PI-HEC，确保 HMX1 在 PA2 区域的精确表达模式。
增强子的分子调控机制
对 hEC1 的深入研究揭示了其调控机制的复杂性。通过基序分析和功能实验，发现 hEC1 的活性和特异性受多种转录因子（TFs）的协同调控，包括 TALE 型同源域转录因子（如 MEIS1、PBX1）、高迁移率族（HMG）盒转录因子（如 TCF7L2）和协调子（Coordinator）基序结合的转录因子（如 TWIST1）。这些转录因子通过结合 hEC1 上的特定基序簇，形成复杂的调控网络，确保增强子在特定细胞和发育阶段的功能。
小鼠模型中的表型与机制验证
在小鼠模型中，mEC1 重复导致 Hmx1 在耳郭基底区和成纤维细胞中异常表达，并扩展至远端区域，引发耳郭发育异常，包括耳轮面积减小、角度改变等，与人类 BCE 表型相似。单细胞测序和批量 RNA 测序显示，Hmx1 异常表达通过抑制成纤维细胞、软骨细胞、肌细胞和表皮细胞的分化相关基因，干扰耳郭的正常发育，揭示了 Hmx1 在颅神经嵴来源的成纤维细胞中的关键作用。
这项研究首次系统阐明了 BCE 的致病机制，证明 PI-HEC 的拷贝数变异通过协同调控 HMX1 的时空表达导致外耳发育异常。研究结果不仅揭示了哺乳动物耳形态发生的复杂调控网络，也为理解增强子与转录因子的协同作用提供了新范式。此外，研究中构建的小鼠模型和发现的关键调控元件，为 BCE 的基因诊断和未来靶向治疗奠定了坚实基础，有望推动颅面畸形领域的精准医学发展。研究还强调了非编码区遗传变异在发育性疾病中的重要性，为解析复杂遗传病的机制提供了新的思路和方法。
