编辑推荐：
本文聚焦碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）感染难题，探究抗菌肽 Cec4 的抗菌机制。发现其低浓度下具快速杀菌、抑制生物膜等作用，能破坏细胞膜、结合核酸，体内实验证实其疗效，为 CRKP 感染治疗提供新方向。
研究背景与 CRKP 感染现状
抗生素滥用导致抗菌药物耐药性成为公共卫生难题，CRKP 作为 ESKAPE 病原体之一，对碳青霉烯类抗生素广泛耐药（耐药率 46%-66%），且对替加环素耐药率上升，黏菌素虽为常用药但 50% 患者用药后可能出现急性肾损伤，亟需新型抗生素。抗菌肽（AMPs）因独特作用机制、对人体无害及不易使细菌产生耐药性等特点，成为新一代抗生素的潜在选择。自 1980 年首次发现天蚕素以来，已有超 3000 种源自昆虫、植物和哺乳动物等的抗菌肽被研究。前期研究表明，Cec4 对革兰氏阴性菌有强效作用，对多重耐药和广泛耐药肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度（MIC）为 4-8 μg/mL，且高浓度（100×MIC）对人红细胞无溶血性，但对 CRKP 的作用尚不明确。
材料与方法
- 菌株与培养条件：使用肺炎克雷伯菌标准菌株 NCTC9633（购自 ATCC）及从贵州某三级医院分离的 CRKP 菌株，在 37°C 的 LB 培养基中过夜培养。
- 肽合成：Cec4 抗菌肽（序列：GWLKKIGKKIERVGQNTRDATIQAIGVAQQAANVAATLKGK）以三氟乙酸（TFA）盐形式合成，纯度＞95%，TFA 残留量＜0.5%，溶于双蒸水配制成 10 mg/mL 溶液，通过在线软件 HeliQuest 分析疏水性，利用 I-TASSER 预测三维空间结构。
- 体外抗菌活性检测：采用微量肉汤稀释法测定 MIC，进行耐药性发展研究、时间依赖性杀菌实验、棋盘法检测与传统抗生素的协同效应，利用结晶紫法评估对生物膜的抑制和清除能力。
- 抗菌机制研究：通过分子动力学模拟、扫描和透射电子显微镜观察、脂多糖和磷脂抑制实验、外膜通透性检测、膜电位和膜流动性测定、活性氧（ROS）检测及 DNA 和 RNA 凝胶阻滞实验等，探究 Cec4 的抗菌机制。
- 体内疗效评估：构建 BALB/c 小鼠皮肤伤口感染模型，分为空白组（PBS 处理）和 Cec4 治疗组（10 mg/kg Cec4 溶液），观察伤口愈合情况，进行细菌计数和组织学分析。
- 转录组分析：对经 Cec4（8 μg/mL）或 PBS 处理 1.5 h 的肺炎克雷伯菌进行 RNA 提取、文库构建和测序，筛选差异表达基因并进行 GO 和 KEGG 富集分析，通过 qRT-PCR 验证 RNA-Seq 结果。
结果
- Cec4 的结构特征：Cec4 具有均匀的极性和非极性氨基酸分布，平均疏水性 0.088，平均疏水矩 0.594，预测形成两亲性结构，二级结构含 68.29%α- 螺旋和 19.51% 无规卷曲，具典型阳离子、两亲性和 α- 螺旋特性。
- 体外抗菌活性：Cec4 对肺炎克雷伯菌标准菌株 ATCC13883、48 株临床分离 CRKP 菌株和 2 株临床分离多粘菌素耐药肺炎克雷伯菌的 MIC 分别为 4 μg/mL、4-8 μg/mL 和 8 μg/mL。连续 20 代亚致死浓度（0.5×MIC）处理后，肺炎克雷伯菌的 MIC 波动 1-2 倍，提示长期使用不易诱导细菌耐药。杀菌动力学显示，Cec4 在 30 min 内即可杀菌，且呈剂量依赖性。与利福平、万古霉素联合时，部分抑菌浓度指数（FICI）≤0.5，显示协同或相加效应；与左氧氟沙星等联合时 FICI＞1，无协同作用。Cec4 在 2 μg/mL（0.5×MIC）及以上浓度可显著抑制生物膜形成，对成熟生物膜也有显著清除作用。
- 抗菌机制：扫描和透射电子显微镜显示，Cec4 处理后细菌膜结构破坏，出现穿孔、皱缩、塌陷和溶解。分子动力学模拟表明，Cec4 与细菌膜磷脂双层相互作用，主要通过带正电的氨基酸残基与带负电的脂质膜静电结合。NPN 和 PI 染色显示，Cec4 以浓度依赖性方式增加外膜和全膜通透性。DiSC3 (5) 和 Laurdan 检测表明，Cec4 使膜电位去极化，膜流动性降低。DCFH-DA 检测显示，Cec4 诱导 ROS 产生，且 ROS 清除剂 NAC 可显著削弱 Cec4 的抗菌活性，提示 ROS 在杀菌中起关键作用。DNA 和 RNA 凝胶阻滞实验证实，Cec4 可结合细菌 DNA 和 RNA。
- 体内疗效：在小鼠皮肤伤口感染模型中，Cec4 治疗组伤口面积在第 7 天和第 11 天分别减少至 57.70% 和 21.39%，显著小于 PBS 组（73.34% 和 36.10%），细菌计数显著降低，组织学分析显示 Cec4 促进表皮再生和真皮恢复，胶原纤维更致密有序。
- 转录组分析：共筛选出 966 个差异表达基因，其中 955 个上调，11 个下调。GO 富集显示差异基因与生物膜、细胞膜、氧化应激等相关；KEGG 富集到 11 条通路，涉及细菌分泌系统、转运系统等。qRT-PCR 验证了部分差异基因的表达变化。
讨论与结论
CRKP 感染率和死亡率高，现有治疗药物有限且存在诸多不足。Cec4 作为一种 α- 螺旋抗菌肽，对 CRKP 具显著抑制作用，具快速杀菌、抗生物膜、不易诱导耐药等优势。其抗菌机制主要包括破坏细胞膜完整性、诱导 ROS 积累、结合核酸等。体内实验证实其能有效抑制 CRKP 感染，促进伤口愈合。转录组分析揭示其通过影响膜蛋白、氧化应激相关基因及核酸合成等发挥作用。本研究为 CRKP 感染的临床治疗提供了新候选药物和理论依据，但 Cec4 在糖尿病等特殊人群伤口愈合中的作用仍需进一步研究。
