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本文聚焦希瓦氏菌（Shewanella oneidensis），探究其 4 种 NADH 脱氢酶（NDH）在有氧及厌氧硝酸盐、亚硝酸盐呼吸中的作用。发现电子受体（EA）转换会引发 NDH 基因转录变化，且全局调控因子 Crp 和 Arc 系统直接调控 4 种 NDH 转录，揭示呼吸链重塑机制。
研究背景与目的
希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）作为呼吸多功能模式菌株，拥有 4 种 NADH 脱氢酶（NDH），包括质子泵型 Nuo、钠泵型 Nqr1 和 Nqr2、非偶联型 Ndh，覆盖三类 NDH 类型。长期以来，NDH 在缺氧条件下的作用被认为非必需，但近年研究发现其参与细胞外电子传递。然而，各 NDH 在厌氧条件下的具体功能，尤其是硝酸盐和亚硝酸盐呼吸中的角色尚不明确。本研究通过构建 NDH 三突变株，系统分析各 NDH 在有氧及厌氧呼吸中的功能，并探究全局调控因子 Crp 和 Arc 系统对 NDH 基因转录的调控机制。
关键实验设计与方法
研究构建了仅保留单一 NDH 的三突变株（如 ΔnuoNΔndhΔnqrF1等），在有氧及厌氧条件下以乳酸为电子供体，分别以硝酸盐（5 mM）、亚硝酸盐（5 mM）为唯一电子受体，监测菌株生长、电子受体消耗及 NDH 基因转录水平。通过实时定量 PCR（RT-qPCR）分析nuoA、nqrA1、nqrA2、ndh的转录变化，并利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和微尺度热泳（MST）验证 Crp 和 ArcA 蛋白与 NDH 启动子区域的直接结合。
主要研究结果
1. NDH 在有氧呼吸中的功能差异
在有氧条件下，三突变株 ΔnuoNΔndhΔnqrF1（仅含 Nqr2）生长速率最低（μ=0.092±0.005 h-1），而 ΔnuoNΔndhΔnqrF2（仅含 Nqr1）生长最稳健（μ=0.121±0.009 h-1），表明 Nqr1 是有氧呼吸的主要 NDH。转录分析显示，有氧条件下nqrA1转录水平显著高于其他 NDH 基因，印证 Nqr1 的主导作用。
2. NDH 在厌氧硝酸盐 / 亚硝酸盐呼吸中的作用
厌氧条件下，以硝酸盐为电子受体时，各三突变株硝酸盐消耗速率与野生型无显著差异，表明单一 NDH 即可满足硝酸盐还原为亚硝酸盐的需求。然而，当以亚硝酸盐为电子受体时，ΔndhΔnqrF1ΔnqrF2（仅含 Nuo）表现出最严重的亚硝酸盐利用缺陷，暗示 Nuo 对亚硝酸盐呼吸贡献最小，可能与亚硝酸盐毒性对 Nuo 的抑制有关。
3. 电子受体转换引发的 NDH 基因转录重塑
在硝酸盐完全还原为亚硝酸盐的过程中，nqrA1转录水平在亚硝酸盐呼吸阶段升高约 1.6 倍，而nqrA2转录下降约 5 倍，呈现相反调控模式。nuoA转录随亚硝酸盐积累逐渐增加 2.5 倍，但功能上对亚硝酸盐呼吸贡献有限；ndh转录则维持稳定，提示其组成型表达特性。
4. Crp 和 Arc 系统对 NDH 基因的直接调控
Crp 对nqr1和nqr2表现出双向调控：硝酸盐条件下，Crp 抑制nqr1并激活nqr2；亚硝酸盐条件下则反之，通过直接结合启动子区域实现转录调控。Arc 系统对两nqr operon 均有弱抑制作用，其调控效应在硝酸盐条件下因 Crp 的主导作用而被部分抵消。此外，Crp 直接结合nuo和ndh启动子，抑制其在硝酸盐呼吸中的转录，而 ArcA 虽能结合nuo启动子，但在亚硝酸盐条件下调控效应不显著。
结论与意义
本研究证实 NDH 在厌氧硝酸盐和亚硝酸盐呼吸中不可或缺，且电子受体转换通过调控 NDH 基因转录重塑呼吸链。全局调控因子 Crp 和 Arc 系统通过直接结合 NDH 启动子，协调不同 NDH 的表达，以适应氧化还原分层环境。其中，Crp 在调控nqr1/nqr2的反向转录响应中起核心作用，而 Arc 系统通过感知醌池氧化还原状态辅助调节。该研究不仅揭示了希瓦氏菌呼吸链在 NADH 氧化环节的动态重塑机制，也为理解原核生物通过全局调控因子适应复杂环境提供了新视角。
