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本文综述布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii, Sb）作为益生菌酵母在基因工程、定植调控、生物标志物传感及药物生产等领域的研究进展，探讨其作为治疗胃肠道疾病平台的潜力及需克服的挑战。
1. 引言
益生菌是摄入足够量时对宿主健康有益的微生物。布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii, Sb）是一种公认安全（GRAS）的益生菌酵母，可缓解腹泻、克罗恩病、肠易激综合征（IBS）和溃疡性结肠炎等胃肠道疾病的症状，因其易于生产，在补充剂和含益生菌的食品中很受欢迎。
Sb与研究充分的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, Sc）关系密切，其基因组相似性极高，更准确地说，Sb应被描述为Sc的一个亚种。然而，与大多数实验室Sc菌株不同，Sb能耐受低 pH，在人体体温 37℃下生长最佳。其他关键区别包括Sb不能形成孢子，也不能消耗半乳糖。研究人员已开始揭示这些特征的基因型基础，例如，在编码Sb的 a 因子（MATa）的基因中已鉴定出 7 个单核苷酸多态性（SNP）和 8 个插入缺失（indel）突变，这些突变共同被认为是导致Sb不产孢表型的原因。反过来，不能产孢被认为是Sb基因组中完全缺乏几个反转录转座子家族的原因。最近还发现，Sb的PGM2基因中的提前终止密码子是其缺乏半乳糖代谢的原因。此外，Sb具有更多参与蛋白质合成和应激反应的基因拷贝数，这可能使Sb能够通过假菌丝转换等机制适应氮缺乏的应激条件。Sb还表达几种负责形成絮凝物的蛋白质，这些蛋白质在低絮凝的Sc菌株中可能被截断。Sb形成絮凝物的能力被认为有助于其抗菌特性，使它能够在病原体粘附到肠细胞之前粘附到病原体上。此外，Sb编码的蛋白酶和磷酸酶可切割艰难梭菌（Clostridiodes difficile）毒素，使其特别适合治疗艰难梭菌感染。与Sc不同，Sb在人体体温下的有氧条件下产生乙酸，并且具有更厚的细胞壁，这可能解释了其在胃肠道中氧气水平较高区域的耐酸性和抗菌特性。总之，Sb和Sc的高度相关性使得能够剖析Sb的独特表型。
除了其天然特性外，Sb通过基因工程成为原位和异位生物制造的有吸引力的平台，并且与益生菌细菌（包括乳酸菌和大肠杆菌 Nissle）相比具有几个独特的方面。例如，Sb可以进行翻译后修饰（PTMs），容易以高滴度分泌重组蛋白，这与大多数细菌不同。它不能产孢或交配，使得Sb不太可能将基因转移到其他微生物，这是工程细菌的一个主要问题。同样与细菌不同，Sb本质上对噬菌体具有抗性，并且不受抗生素的影响，这使得它可以给接受抗生素或噬菌体治疗的患者使用。与细菌一样，Sb也可以在无菌小鼠中定植，并且在常规小鼠中增强定植的方案已经很成熟，使其成为临床前研究的理想选择。从患者依从性的角度来看，Sb在胶囊中冻干后仍能保持活力，并且与某些细菌（如大肠杆菌 Nissle）不同，作为液体悬浮液易于服用。这些特性为将Sb用作未来生物治疗应用的底盘提供了良好的基础。Sb的耐温性和耐酸性也使其成为发酵药物（从小分子药物到生物制剂）的强大平台。尽管有这些优势，但迄今为止，没有工程化的Sb菌株（或其他微生物）进入临床，因此对当前工程努力进行现实评估尤为及时。
在本综述中，我们将总结和评论这种新兴的Sb益生菌底盘在向人体肠道输送药物方面的工程研究的最新进展。我们采用自下而上的方法，首先描述Sb不断增长的遗传工具包，然后描述改善Sb在肠道定植的能力、感知周围环境并最终治疗疾病的方法。本文介绍了重要的基础研究和最新研究，强调了加速Sb治疗潜力必须克服的关键障碍，并提出了实现这一目标的几种新方法。
2. Sb的遗传工具包
可靠的遗传工具是工程化Sb以提供生物治疗剂的先决条件。幸运的是，为Sc开发的许多遗传工具已被改编用于Sb，尽管需要一些Sb特定的修改。本节将介绍在Sb中进行转化、将 DNA 整合到基因组中、选择活性启动子和分泌重组蛋白的最新进展。重点将放在使能技术上，而不是后面章节中描述的具体应用。
2.1 转化
为Sc开发的 DNA 转化技术在Sb中只需进行最小限度的优化即可有效应用。酵母常用的两种转化方法是醋酸锂 / 聚乙二醇 / 单链 DNA 法和电穿孔法。醋酸锂 / 聚乙二醇 / 单链 DNA 转化方法依赖阳离子软化细胞壁并破坏细胞膜周围的离子相互作用，然后通过热激步骤促进 DNA 摄取。感兴趣的 DNA 与单链载体（通常是鲑鱼精子 DNA）的复合促进了 DNA 的进入。2014 年，Douradinha 等人比较了这种方法在Sc和Sb中的效果。虽然Sb的转化效率较低，但醋酸锂方法只需进行最小的优化即可成功，即生长步骤在 37℃而不是 30℃下进行。除了对Sb使用更高的生长温度外，Durmusoglu 等人还发现，将转化物在 42℃下孵育 1 小时是产生成功转化子的最佳时间。
另一种常用于酵母的转化方法是电穿孔法。电穿孔利用电流破坏细胞壁和细胞膜，促进外源 DNA 的进入。正如 Benatuil 等人所示，已经对Sc的电穿孔方案进行了广泛的优化。一些可操作的变量包括细胞密度、细胞调理剂和电穿孔缓冲液中的成分。Benatuil 等人表明，Sc电穿孔最重要的两个方面是用 LiAc 或 DTT 进行的细胞调理步骤以及在电穿孔缓冲液中加入山梨醇。如果没有这些预处理步骤，转化效率会大幅下降，没有 LiAc 时效率下降 88%，没有 DTT 时效率下降 94%。与排除预处理步骤的结果类似，当电穿孔缓冲液中不含山梨醇时，转化效率下降超过 97%。使用他们优化的Sc电穿孔方法，Benatuil 等人观察到转化效率高达每 1μg 载体 DNA 产生 1.3×108个菌落。为了专门测试Sb的电穿孔效率，Hamedi 等人使用了 Benatuil 等人开发的Sc电穿孔方案，该方案每 1μg 质粒仅产生数百个Sb菌落。最终，Douradinha 等人、Durmusoglu 等人和 Hamedi 等人的结果表明，最初在Sc中开发的转化方法可以转移到Sb，尽管效率不同。
2.2 含质粒菌株的选择方法
Sb和Sc维持质粒转化子的策略相似。2μ（高拷贝附加型）和 CEN/ARS（低拷贝着丝粒型）复制起点在酵母中都很常用。幸运的是，Sb可以复制基于 2μ 和 CEN/ARS 的质粒，尽管拷贝数差异有待确定。尽管Sb对许多与Sc相同的抗真菌剂敏感，并且使用了相同的相应抗性基因，如KanMX、ZeoR、NatR和HygR，但在体内使用抗真菌剂作为选择标记是不可取的，因为这些试剂会破坏微生物组。相反，大多数研究利用工程化的尿嘧啶、组氨酸、色氨酸和亮氨酸营养缺陷型来维持重组质粒。尿嘧啶营养缺陷型最初是通过紫外线诱变和选择 5 - 氟乳清酸抗性获得的。不幸的是，正如两项研究中所观察到的，紫外线诱变可能导致脱靶突变。Wang 等人还使用 Cre-Lox 系统在Sb中创建了尿嘧啶营养缺陷型，如之前在Sc中所验证的。Cre-Lox 系统比紫外线诱变更具靶向性，脱靶突变的可能性更低。然而，它不是一种无疤痕编辑技术，因为它会留下 loxP 位点。为了克服这个问题，Liu 等人使用 CRISPR/Cas9 介导的编辑使Sb的URA3（尿嘧啶）、TRP1（色氨酸）、HIS3（组氨酸）和LEU2（亮氨酸）基因失活。因此，这项研究提供了三个额外的Sb营养缺陷型菌株，并验证了使用 CRISPR-Cas9 操纵Sb的方法。这种方法与紫外线诱变不同，具有高度的靶向性，并且与 Cre-Lox 不同，是无疤痕的。Liu 的研究成功创建了四个单营养缺陷型菌株和一个双营养缺陷型菌株（ura3/his3）；他们还表明，最初为Sc设计的工具和质粒可以以相对高的成功率应用于Sb。这些基础出版物产生了至今仍在使用的第一个Sb营养缺陷型菌株。
尽管取得了这些成功，但体内维持质粒的最合适策略仍有待确定。虽然基因组整合（如下所述）不需要选择，但质粒在易用性和高拷贝数方面具有显著优势。肠道的营养丰富环境似乎排除了上述四种营养缺陷型。然而，Durmusoglu 等人观察到，在无菌小鼠肠道中，编码尿嘧啶原养型和 β- 胡萝卜素生产的质粒在 14 天内没有检测到丢失。这是反映无菌肠道中真正缺乏尿嘧啶，还是 β- 胡萝卜素生产的选择优势，目前尚不清楚。尽管如此，未来的工作应该开发利用必需基因（可能类似于大肠杆菌中的二氨基庚二酸营养缺陷型）或代谢外部提供的碳源的质粒系统，以确保质粒在胃肠道中的维持。
2.3 基因组整合
在生物治疗工程中，与基于质粒的表达相比，DNA 的基因组整合变得越来越流行。这是因为整合到基因组中使插入的 DNA 更稳定，对宿主细胞的负担更小，并且不需要选择方案。Sb中基因组编辑的具体方法在很大程度上与Sc中使用的方法相似，据报道，这两种菌株之间没有差异。尽管基因组整合具有优势，但这种方法受益于充分表征的基因组整合位点，因为不同的基因组区域实现不同的相对表达水平。
在Sb中进行基因组整合的最早研究是由 Douradinha 等人进行的，他们使用两侧带有 δ 位点的 DNA 将外源 DNA 整合到基因组上这些通常重复的位置。然而，由于Sb缺乏Sc中发现的许多 δ 位点，该系统被认为不太适合整合。最近为Sb探索的另一种整合方法是 PiggyBac 转座子系统。该转座子系统使用 PBase 识别位点将表达盒从质粒中切割出来，并将其粘贴到Sb基因组中。PiggyBac 转座可能是Sb的一种有前途的基因组编辑技术，因为它不会因染色体重排而导致基因组不稳定，并且可以整合包含多个基因的大 DNA 片段。其他用于将外源 DNA 整合到酵母基因组中的方法包括 Cre-Lox 和 CRISPR。如上所述，使用基于 CRISPR 的方法进行基因组整合的主要优点是它具有靶向性和无疤痕性。在Sc中已经鉴定出许多不同染色体上用于稳定染色体整合的中性位置，称为整合位点，并根据它们实现的表达水平进行了表征。Durmusoglu 等人还在Sb的五个整合位点表征了两种荧光报告基因（mRuby2 和 mTurquoise2）的表达，并测量了每个位点的基因表达。五个整合位点的表达各不相同，但两个基因之间的基因表达模式相似。这些观察结果，加上关于Sc中整合位点的大量知识，包括便携式工具包，如用于模块化多部件组装的酵母工具包（YTK）和多重酵母工具包，可能有助于生成稳定的酵母治疗剂。展望未来，应该研究不同基因组整合位点在不同环境条件下的适用性，包括肠道中的条件。
2.4 启动子文库
启动子文库对于活治疗剂的开发至关重要，因为它们允许微调基因表达，例如，平衡和最大化代谢途径的通量，或维持药物生产在其治疗窗口内。Douradinha 等人在Sc中鉴定了一些与Sb具有高同源性的充分表征的启动子。然而，这项研究没有表征它们的表达。2021 年，Durmusoglu 等人在Sb中表征了 18 个组成型Sc启动子。对于大多数测试的启动子，Sb和Sc中的表达水平相似，除了pALD6，其在Sb中比在Sc中强得多。2024 年，Sands 等人分析了 12 个与Sc具有高序列同源性的组成型Sb启动子，并表征了它们在Sb中的表达水平。这些启动子在不同条件下进行了测试，包括需氧、厌氧、不同碳源以及在胃肠道中。Sands 等人证实，Sb中的启动子表达水平通常与Sc启动子表达的预期模式一致。然而，在几种情况下，表达出现偏差，例如表达水平取决于特定的碳源。Sands 等人观察到，在果糖中生长的菌株具有与在葡萄糖中观察到的相似的启动子表达谱，而蔗糖似乎对启动子表达具有总体负面影响。除了蔗糖和果糖，Sands 等人还测试了菊粉和乙酸盐作为碳源。在乙酸盐中生长的菌株的启动子表达谱似乎严重依赖于氧气的存在，而在菊粉中生长的菌株的表达水平通常升高。除了这些组成型启动子外，2024 年，Durmusoglu、Al’Abri 和 Haller 等人测量了五个诱导型启动子的活性。这些启动子对半乳糖、木糖、异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷（IPTG）、铜或 anhydrotetracycline 有反应。所有五个启动子都可以根据诱导剂水平调节表达，但启动子具有不同水平的未诱导酵母表达（即泄漏）和串扰水平。令人兴奋的是，这些诱导系统可以连接形成简单的逻辑电路，如与门，在体外和体内都有活性。这些研究是Sb工程的重要基础，因为它们允许研究人员快速为其应用选择所需的启动子。展望未来，现有的酵母工具包，如 YTK，将受益于其在不同酵母物种（包括Sb）中的性能数据的扩充。
2.5 分泌和表面展示
酵母中的分泌途径很复杂，依赖许多伴侣蛋白来操纵新生蛋白质并将其运输到细胞表面和细胞外环境。正如 Meirong 等人所概述的，目前工程化酵母分泌的努力集中在三个主要领域：分泌信号优化、内质网（ER）折叠和囊泡运输。分泌信号是短的 N 端肽，协助蛋白质转运到内质网和内质网后分选。一旦进入内质网，许多伴侣蛋白促进修饰，包括折叠和糖基化。离开内质网后，囊泡将修饰后的蛋白质运输到高尔基体，经过进一步修饰和信号序列切割后，向细胞壁方向进行胞吐作用。
工程化信号序列已成为调节蛋白质分泌速率的流行策略，因为它需要改变蛋白质序列，而不是进行广泛的菌株工程。信号序列由前序列和前导序列组成，前序列决定新生蛋白质进入内质网的转运方法，前导序列控制从反式高尔基体网络退出后的分选。
