编辑推荐：
该综述聚焦肿瘤异质性导致的治疗难题，探讨双 / 多有效载荷抗体药物偶联物（ADCs）。其结合化疗、放疗药物与抗体载体免疫特性，分析 linker、螯合剂、药物抗体比（DAR）等影响，预测人体剂量与毒性，为攻克耐药提供新方向。
肿瘤异质性是传统癌症治疗失败的重要原因，可导致肿瘤复发、转移，带来严峻临床挑战。近几十年来，基于抗体的免疫疗法成为对抗癌症的有希望的新支柱。尽管与未结合抗体相比，单有效载荷抗体药物偶联物（ADCs）显著改善了患者预后，但癌细胞固有的多种原发性和获得性耐药机制使患者结果不尽如人意。新研究正探索使用双有效载荷和多有效载荷 ADCs 来增强疗效，这些有效载荷包括化疗和 / 或放疗药物，其方法利用不同有效载荷的协同效应以及抗体载体的免疫治疗特性。
多 / 双有效载荷 ADCs
目前双有效载荷或多有效载荷 ADCs 尚未进入临床试验，但多项体外和临床前研究已完成。大多数此类 ADCs 使用 HER2 靶向抗体，尤其是曲妥珠单抗，对 HER2 阳性癌症显示出增强的疗效。例如，cAC10 抗体在体外和体内研究中，通过不可裂解的马来酰亚胺 - 奥瑞他汀和 PEG24基团连接 vc-MMAF 和 vc-MMAE，对霍奇金淋巴瘤具有治疗作用，产生旁观者效应使肿瘤治愈。曲妥珠单抗在多种癌症研究中被广泛应用，如在乳腺癌和结直肠癌的体外研究中，通过可裂解的 A114C-ValCitPABC_Aur-0101 连接子连接 MMAD 和奥瑞他汀；在胃癌和耐药乳腺癌的体内研究中，利用基于 [乙二胺铂（II）]2+的不可裂解阳离子金属 - 有机连接子（Lx 技术）连接奥瑞他汀 F、89Zr - 去铁胺（DFO）和195mPt 等。
作用机制与协同作用
两种药物的协同相互作用是药理学和医学领域的重要课题。化疗药物可增强放射治疗的效果，等剂量线图是说明协同作用的常用方法之一，其分为超加性区域（协同相互作用）和亚加性区域（拮抗相互作用），由加性线分隔。化疗药物通常通过三种不同的作用机制发挥作用，有些作为 DNA 嵌入剂，有些表现出抗微管蛋白活性，还有些作为拓扑异构酶抑制剂，另外还有免疫调节药物。放射性核素的治疗价值主要源于次级低能电子（<30 eV）的直接或间接相互作用，其可诱导 DNA 簇损伤。多 / 双有效载荷抗体偶联物可将具有不同作用机制的药物（如两种或多种化疗药物，或化疗药物与治疗性放射性核素）结合成新型靶向抗癌剂。一些研究表明，双有效载荷抗体偶联物在治疗耐药癌症类型如 HER2+、三阴性乳腺癌和 KRAS/BRAFV600E突变结直肠癌时可显著根除肿瘤，这在很大程度上归因于 “旁观者有效载荷” 或其通过受体阳性细胞释放到周围环境中的 “分解代谢物”，可诱导低受体水平或不表达受体的癌细胞死亡。
含两种抗微管蛋白药物的双弹头 ADC 的协同作用
Yamazaki 等人开发了曲妥珠单抗的双有效载荷版本，以增强对 HER2 阳性（HER2+）难治性乳腺癌的疗效。该研究评估了各种药物抗体比（DAR）配置，包括 MMAE/MMAF 比例为（2+2）、（2+4）和（4+2），发现 MMAE/MMAF（4+2）组合最有效，在低和高 HER2 + 细胞系和肿瘤模型中实现了最大的细胞毒性和肿瘤生长抑制。这种双有效载荷 ADC 表现出超加性效应，与单有效载荷或游离药物治疗相比，抗肿瘤效果更佳。药物分子通过可裂解的连接子（由谷氨酸、缬氨酸和瓜氨酸（GluValCit）组成）连接到曲妥珠单抗 Fc 结构域的侧链上，并通过对氨基苄氧基羰基（PABC）间隔基连接，旨在在表达组织蛋白酶 B 的癌细胞内选择性释放有效载荷。在安全性研究中，未在 HER2 阴性细胞系中观察到显著毒性，给 naive 和荷瘤小鼠施用 20 或 40 mg/kg 后，血液化学和体重分析显示无毒性迹象。
含诊疗放射性核素的双弹头 ADC 的协同作用
Ilovich 等人引入了一种创新方法 —— 双同位素冷冻成像定量放射自显影术（CIQA），以可视化化疗有效载荷（[3H] H-MMAE）渗入非靶向癌细胞的情况，该技术使研究人员能够跟踪肿瘤组织内的 ADCs 及其有效载荷（MMAE 和111In），揭示了旁观者效应。Muns 等人开发的 ADC 利用 Lx 连接子，标记有放射性铂 - 195m（195mPt）和非放射性 DNA 合成抑制铂（II），以及锆 - 89（[89Zr] Zr）。该 ADC 具有独特的金属 - 有机阳离子连接子（LinXis），与组氨酸残基结合，允许与奥瑞他汀 F（AF）和诊疗同位素（[89Zr] Zr 和 [195mPt] Pt）双重偶联。在 HER2 + 胃癌 NCI-N87 和曲妥珠单抗 - DM1（T-DM1）耐药乳腺癌 JIMT-1 细胞系的小鼠模型中，该诊疗双有效载荷抗体偶联物显示出最佳的药代动力学和抗肿瘤效果，实现了高肿瘤保留和特异性，且在剂量低于 60 mg/kg 时具有良好的安全性和耐受性。
含细胞毒性和免疫调节药物的双弹头 ADC 的协同作用
Zhou 及其同事开发了一种靶向 CD276（三阴性乳腺癌细胞中常见过度表达的生物标志物）的新型双有效载荷 ADC。该 ADC 设计有双功能连接子系统，允许在抗体的不同位点偶联两种不同的有效载荷，第一种有效载荷 MMAF 通过双功能二溴马来酰亚胺（DBM）连接子经半胱氨酸和赖氨酸残基偶联，第二种咪喹莫特（IMQ）通过叠氮反应偶联。MMAF 是一种抗有丝分裂剂，可抑制微管蛋白聚合，破坏细胞分裂并导致癌细胞死亡；IMQ 是一种 toll 样受体（TLR）7/8 激动剂，可通过 TLR 7/8 激活免疫通路，增强机体对三阴性乳腺癌细胞的免疫反应。这种组合提供了一种定制策略，可提高抗肿瘤效果，同时刺激免疫系统将 “冷” 肿瘤微环境（TME）转化为 “热” 肿瘤微环境。该 ADC 对 MMAF 的药物抗体比为 3-4，对 IMQ 的药物抗体比更高，为 7-14。用该 ADC 治疗荷三阴性乳腺癌患者来源的异种移植（PDX）小鼠，可在第 7 天完全根除肿瘤，且在监测的第一个月内无复发，与游离药物或单有效载荷 ADCs 相比显示出协同效应，同时对三阴性乳腺癌细胞具有高特异性，全身毒性最小。
非协同作用的报告
尽管有几项支持双有效载荷协同相互作用的报告，但一些研究表明这种协同作用并不总是存在。Nilchan 等人报告了对曲妥珠单抗基硫代硒单抗的评估，该抗体通过偶联 DNA 交联剂 PNU-159682 和 MMAF，针对 HER2 + 乳腺癌模型。尽管表现出高细胞毒性，但该双有效载荷 ADC 既无拮抗作用也无协同作用，得出结论认为两种细胞毒性剂的靶向和非靶向效应会降低总体治疗指数或安全性。此外，Kumar 等人研究了曲妥珠单抗与 MMAE 和吡咯并苯并二氮杂卓（PBD，一种 DNA 烷基化剂）有效载荷偶联的体外细胞毒性，使用连接到 Fc 结构域半胱氨酸残基的异三功能柔性连接子，允许偶联 MMAE 和 PBD。尽管对 HER2 + 乳腺癌细胞有体外细胞毒性，但在体内未观察到超加性效应。
连接子
连接子是 ADC 中连接有效载荷和抗体的桥梁，其类型显著影响 ADC 的药代动力学、抗肿瘤疗效和安全性，影响因素包括与抗体的相互作用位点、疏水性、电荷、灵活性、稳定性和长度。双有效载荷 ADC 连接子可分为可裂解和不可裂解两大类，可裂解连接子包括基于二硫键（对细胞质中的还原环境敏感，还原时释放有效载荷）、肽（被溶酶体中的蛋白酶如组织蛋白酶切割）、腙（酸敏感连接子，在内涵体或溶酶体的低 pH 环境中释放有效载荷）和 β- 葡萄糖醛酸酶敏感（被肿瘤中常过度表达的葡萄糖醛酸酶切割）的连接子；不可裂解连接子使有效载荷残基保留在抗体上，需要额外处理才能激活药物，大多数用于连接治疗性放射性核素（如 [225Ac] Ac 和 [177Lu] Lu）的螯合剂属于此类。
诊疗放射性金属螯合剂
多年来，已开发出几种双功能螯合剂，用于将金属放射性核素稳定螯合到单克隆抗体上，通常采用异硫氰酸酯（NCS）化学与单克隆抗体上的随机赖氨酸胺共价偶联，在放射免疫治疗中产生稳定的相互作用。值得注意的放射性金属螯合剂包括 DFO、DOTA、p-SCN-Bn-1B-DTPA、PEPA、p-SCN-Bn-PEPA、HEHA、p-SCN-Bn-HEHA 等。到目前为止，已用于双有效载荷抗体偶联物的双功能螯合剂包括 p-SCN-Bn-Macropa、p-SCN-Bn-DFO 和 p-SCN-Bn-NOTA，尽管其他发射 α 粒子的放射性金属双功能螯合剂（如 p-SCN-Bn-DOTA 和 p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA）在这方面也有很大潜力。
双有效载荷抗体偶联物的偶联策略
ADCs 中双有效载荷偶联通常有两种策略：随机偶联和位点特异性偶联。随机偶联通常使用类似于天然抗体结构的天然构建块，活性酯或马来酰亚胺用于基于胺的赖氨酸偶联，以及基于硫醇的半胱氨酸偶联（在与未修饰单克隆抗体（mAbs）偶联的药物的铰链区），人 IgG 抗体含有约 80 个赖氨酸残基，其中约 20 个高度可及，此外，每个人 IgG1 抗体中已鉴定出总共 32 个半胱氨酸。相比之下，位点特异性偶联利用通过各种方法在 mAbs 的特定位点引入的化学残基，遗传引入的残基可包括半胱氨酸、非天然氨基酸和设计用于生物正交或酶促偶联的基序。
药物抗体比（DAR）的作用
除了连接子在决定双有效载荷 ADCs 的稳定性、生物分布概况、毒性和抗肿瘤疗效中的作用外，DAR 已成为这些疗法在癌症治疗中的一个关键因素。最近的报告表明，ADCs 的异质混合物的 DAR 范围为 0 到 8。一些研究表明，DAR 较高的 ADCs 更有可能通过肝脏消除，而 DAR 较低的 ADCs 表现出对肝脏代谢的抗性，其药代动力学与裸抗体（DAR 0）相似。生物分布概况显示，血清双相消除与 DAR 成比例，DAR 0、DAR 2.6 和 DAR 5.2 的生物半衰期（t1/2）分别为 11 小时、9 小时和 5 小时。然而，必须考虑其他因素，如药物偶联后 ADC 的表面电荷，通常，整个 mAbs 的净正电荷增加可导致组织保留增加和血液清除增加。高 DAR 可对 ADC 的受体亲和力产生负面影响，导致毒性、清除率减慢和过早释放的风险增加，因此，为每种药物选择最佳 DAR 范围至关重要，尤其是在处理包含用于靶向放射治疗的放射性同位素的双有效载荷时，必须考虑放射治疗源引起的影响抗体结构的放射 olysis 过程，此外，在不增加健康组织毒性的情况下平衡两种有效载荷的效力仍然是一个关键焦点领域。
结论
第一代双有效载荷单克隆抗体的初步临床前概念验证显示出在诊疗应用中的巨大潜力，与单有效载荷和裸抗体相比，这些抗体似乎增强了荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效并提高了生存率，同时保持了安全性。如表 1 所示，大多数双有效载荷 ADCs 基于曲妥珠单抗（一种充分表征的抗 HER2 抗体），曲妥珠单抗是 IgG1 亚类，含有 88 个赖氨酸残基、4 个 N - 末端基团和 32 个形成二硫键的半胱氨酸残基。下一代双有效载荷 ADCs 预计将纳入靶向其他受体的其他类 mAbs，此外，使用双特异性和双位抗体开发双 / 多有效载荷 ADCs / 诊疗剂可能为更有效和更安全的抗癌剂提供前所未有的机会，与完整 IgGs 一起使用的成功策略也可应用于抗体片段和纳米抗体。自 2011 年以来，已开发出多种 FDA 批准的单克隆抗体，用于靶向各种受体进行治疗，每种抗体都有双有效载荷偶联的潜力，尤其是那些具有较高表面官能团数量的抗体，从而为增强这些抗癌剂的有效性以改善患者预后提供了前所未有的选择。许多早期研究集中于高 LET 短程 α 发射体（如225Ac）和俄歇发射体（如195mPt），目前，新一代双有效载荷放射免疫偶联物（RICs）正在出现，其特征是含有 FDA 批准的低 LET、长程 β 发射体（如177Lu），并与 FDA 批准的化疗药物（如苯丁酸氮芥）配对，苯丁酸氮芥主要与人类基因组中的鸟嘌呤碱基形成共价加合物。这种与低 LET 相关的进展已显示出不仅在治疗和成像转移性和血液癌症（如淋巴瘤）方面有效，而且在治疗较大的实体瘤方面也有效，这要归功于177Lu 发射的 β 粒子的 “交叉火力” 效应。因此，作者建议，将其他 FDA 批准的鸟嘌呤碱基 DNA 嵌入剂化疗药物（如顺铂、奥沙利铂和卡铂）作为新的有效载荷与低和高 LET 放射性同位素一起使用可能具有重要意义，RICs 和 ADCs 中化疗有效载荷的选择应根据所治疗的特定癌症类型进行定制。
