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为探究 CLIC 蛋白抗氧化作用，研究人员以人皮肤成纤维细胞等为对象，通过 siRNA 敲除、过表达及外源性添加重组 CLIC（rCLIC）蛋白等实验，发现 rCLIC1/4 可通过氧化还原酶活性保护细胞免受 H?O?诱导的氧化损伤，效果优于部分已知抗氧化剂。
氧化应激是皮肤衰老、炎症及多种疾病的核心机制之一，活性氧（ROS）的过度积累会损伤细胞成分，而内源性抗氧化系统的不足使得开发外源性保护策略成为迫切需求。目前，尽管谷胱甘肽转移酶（GST）、谷氧还蛋白（Grx）等抗氧化酶的作用已被广泛研究，但新型抗氧化蛋白的挖掘仍存在空白。氯离子细胞内离子通道（CLIC）家族蛋白兼具离子通道和氧化还原酶活性，但其在皮肤细胞中的抗氧化功能尚未被系统阐明。在此背景下，来自国外研究机构的科研团队开展了一系列研究，旨在揭示 CLIC 蛋白在氧化应激中的作用机制及其作为外源性抗氧化剂的潜力，相关成果发表在《Advances in Redox Research》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过 siRNA 瞬时敲除人真皮成纤维细胞（HDF）、人表皮角质形成细胞（HKE）及小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 中的 CLIC1 或 CLIC4，利用 Western blot 验证敲除效率；构建稳定过表达 CLIC1/4 的 NIH/3T3 细胞系；表达并纯化重组 CLIC（rCLIC）蛋白，通过免疫荧光确认其细胞内摄取；运用 WST-1 法检测细胞活力，HEDS assay 测定氧化还原酶活性，荧光探针检测 ROS 水平；并通过免疫荧光染色分析 CLIC 蛋白在人及小鼠皮肤组织中的表达分布。
1. CLIC1/4 敲除对细胞活力及氧化还原酶活性的影响
通过 siRNA 敲除实验发现，CLIC1-KD、CLIC4-KD 及 Double-KD 细胞的 CLIC 蛋白表达显著降低，细胞活力较对照组下降约 20%-41%，且对 H?O?诱导的氧化应激更敏感，ROS 水平显著升高。HEDS assay 显示，敲除细胞的氧化还原酶活性显著降低，而加入抑制剂 IAA-94 后活性进一步下降，表明 CLIC1/4 对细胞内氧化还原平衡至关重要。
2. CLIC1/4 过表达对氧化应激的保护作用
稳定过表达 CLIC1/4 的 NIH/3T3 细胞表现出更高的氧化还原酶活性，且在 H?O?处理后细胞活力下降幅度显著低于对照组，ROS 生成减少约 50%。这表明 CLIC1/4 的高表达可增强细胞抗氧化能力，维持 redox 稳态。
3. 外源性 rCLIC 蛋白的抗氧化功能
外源性添加 rCLIC1/4 至 HDF 和 HKE 细胞后，免疫荧光证实其被细胞有效摄取。优化浓度下，rCLIC1/4 可显著提高细胞对 H?O?的耐受性，减少 LDH 释放，降低 ROS 水平。与 Grx、GST-Ω 及 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）相比，rCLIC1/4 的保护效果相当或更优。而 rCLIC3 无显著保护作用，提示其功能特异性。
4. 氧化还原酶活性对保护作用的决定性
通过构建 CLIC1 突变体（C24A、K37A）并外源性添加，发现突变体失去保护能力，证实其抗氧化作用依赖于保守的半胱氨酸和赖氨酸残基，即氧化还原酶活性是关键。进一步实验显示，抑制剂 IAA-94 可阻断 rCLIC 的保护作用，印证了酶活性的必要性。
5. CLIC 蛋白在皮肤组织中的表达分布
免疫荧光显示，CLIC1/4 在人及小鼠皮肤的表皮层高表达，且随年龄增长，CLIC4 表达下降而 CLIC1 分布更集中于上层表皮。这种时空表达差异可能与皮肤抗氧化能力的年龄相关性变化相关。
研究结论表明，CLIC1 和 CLIC4 通过氧化还原酶活性发挥抗氧化作用，外源性添加 rCLIC1/4 可有效保护皮肤细胞免受氧化损伤，其效果与已知抗氧化酶相当，且依赖于保守的酶活性位点。该研究不仅拓展了 CLIC 蛋白的功能认知，还为开发新型抗氧化剂提供了潜在靶点，尤其在皮肤抗衰老、炎症性疾病及氧化应激相关病症的防治中具有重要意义。未来研究可进一步探索其在体内的作用机制及递送策略，推动临床转化应用。
