SPOP 介导的蛋白泛素化中长降解子的序列规则及其分子机制研究

为明确 SPOP 介导底物结合及降解的序列规则，研究人员以 MyD88 为模型，发现其通过含 SPOP 结合共识（SBC）和 N 端 Q 基序的长降解子与 SPOP 互作。该机制亦存在于 SRC-3 等底物，揭示了 SPOP 底物识别的新序列规则，为相关疾病研究提供方向。

　　

在细胞的生命活动中，蛋白质的泛素化修饰如同一位精密的 “调控师”，负责调控蛋白质的命运，从降解到功能调节，无所不在。其中，E3 泛素连接酶作为这一过程的关键执行者，其底物识别机制一直是生命科学领域的研究热点。SPOP（speckle-type BTB/POZ protein）作为 Cul3-Rbx1 亚类 E3 连接酶的衔接蛋白，能招募底物蛋白使其泛素化，在免疫信号调控等多种生理过程中扮演重要角色。然而，长期以来，SPOP 介导底物结合和降解的序列规则尚未完全明晰，尤其是像 MyD88（myeloid differentiation primary response 88）这类关键免疫信号分子的互作机制，仍存在诸多谜团。MyD88 作为 Myddosome 复合物的核心组分，在 toll 样受体（TLR）介导的免疫应答中起着信号中继站的作用，其异常表达与多种炎症性疾病及癌症的发生发展密切相关。而 SPOP 通过介导 MyD88 的 K⁴⁸位泛素化及降解，负向调控免疫信号，但其具体如何精准识别 MyD88 等底物，以及是否存在通用的序列模式，成为亟待解决的科学问题。

为了揭开这些谜团，来自国外研究机构的研究人员开展了一系列深入研究。他们以 MyD88 为主要研究对象，结合生物化学、结构生物学及细胞生物学等多学科手段，系统解析了 SPOP 与底物互作的分子机制。研究发现，SPOP 识别底物需要依赖一种新型的长降解子序列，该研究成果发表在《Biochemical Journal》上。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：

• 荧光偏振（FP）分析：用于定量检测 MyD88 等底物肽段与 SPOP^MATH结构域的结合亲和力，通过荧光标记肽段，分析不同序列突变对结合能力的影响。
• 等温滴定量热法（ITC）：进一步验证高亲和力结合的热力学参数，明确互作的特异性和强度。
• X 射线晶体学：解析 SPOP^MATH与 MyD88 及其他底物肽段的复合物晶体结构，从原子水平揭示互作的分子基础，包括氢键、疏水作用等具体作用力模式。
• 细胞内免疫共沉淀及降解实验：在 HEK293T、BJAB 等细胞中，通过突变分析验证 Q 基序和 SBC 在 SPOP 与底物互作及 MyD88 降解中的功能必要性。

研究结果

1. MyD88 与 SPOP 的互作区域长于已知的 SBC

通过序列比对和 AlphaFold2 结构预测，发现 MyD88 在其 SBC（¹³⁴VDSSV¹³⁸）的 N 端存在一段保守的非结构化区域。FP 和 ITC 实验表明，包含该区域的长肽段（如^5Flu-AEKPLQVAAVDSSVP）与 SPOP^MATH的结合亲和力（K_d=0.26±0.07 μM）显著高于仅含 SBC 的短肽段（K_d=32.25±2.08 μM），证实 N 端区域对高亲和力互作至关重要。

2. SPOP^MATH-MyD88 互作的结构基础

解析 MyD88 长肽与 SPOP^MATH的 1.9 ? 晶体结构显示，MyD88 肽段结合于 SPOP^MATH表面的凹槽中。SBC 的前四个残基（¹³⁴VDSS¹³⁷）通过疏水作用和氢键与 SPOP 的保守位点结合，而 N 端的¹²⁷KPLQV¹³¹区域则形成独特的互作模式：Leu¹²⁹和 Gln¹³⁰嵌入 SPOP 的疏水口袋（由 Phe¹³⁶、Ile¹³⁷、Phe¹⁴¹组成），其中 Gln¹³⁰与 SPOP 的 Lys¹¹⁵和 Phe¹³⁶主链羰基形成氢键，稳定了复合物结构。

3. 高亲和力互作依赖于 SBC N 端的 Q 基序

单点突变实验显示，SBC 关键位点（如 Val¹³⁴、Ser¹³⁶）及 N 端 LQ^129-130突变均显著削弱结合能力，其中 L129A 和 Q130A 突变的影响与 SBC 突变相当。细胞内实验表明，Q 基序突变导致 MyD88 稳定性显著升高，半衰期延长，证实其对 SPOP 介导的泛素化降解不可或缺。

4. SPOP 底物降解子需同时具备 SBC 和 Q 基序

通过序列比对和结构叠合，发现 Pdx1 等其他 SPOP 底物的 N 端也存在类似的谷氨酰胺（Q）位点，该位点与 MyD88 的 Gln¹³⁰在 SPOP 的疏水口袋中占据相同位置，形成保守互作模式。进一步在 GLI2、SRC-3 等 6 种底物中验证了长降解子模型，其包含的 Q 基序（-5 至 - 4 位）和 SBC（+1 至 + 5 位）共同决定了与 SPOP 的高亲和力结合。

5. 新型长降解子共识序列的提出

综合实验结果，研究人员提出了 SPOP 底物的新型长降解子共识序列：λ-Q-X-X-X-φ-π-S-X-X（λ 为中到大分子氨基酸，φ 为非极性氨基酸，π 为极性氨基酸）。该序列整合了 Q 基序和 SBC，其中 SBC 的 + 4、+5 位具有更高的序列宽容性，为预测和筛选 SPOP 底物提供了新的理论依据。

研究结论与讨论

本研究首次揭示了 SPOP 介导底物识别的 “双位点” 机制 —— 即除了已知的 SBC 外，N 端的 Q 基序通过与 SPOP MATH 结构域的特定疏水口袋结合，显著增强互作亲和力。这一发现拓展了 SPOP 底物识别的序列规则，解释了为何部分底物（如 MyD88）的 SBC 虽不完全符合经典共识，仍能被高效识别的分子机制。

研究还发现，Q 基序在多种生理和病理相关的 SPOP 底物（如癌症相关的 SRC-3、SETD2）中高度保守，提示其可能成为干预 SPOP 功能的潜在靶点。例如，MyD88 在弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）中常发生突变，其 SPOP 结合区域的突变可能通过破坏 Q 基序 - SPOP 互作，阻碍 MyD88 降解，进而激活异常免疫信号，推动肿瘤进展。这为解析相关疾病的发病机制及开发靶向疗法提供了新思路。

此外，新型长降解子模型的建立，将有助于通过生物信息学和深度学习方法系统性挖掘 SPOP 底物，加速对 SPOP 调控网络的全面认知。从更广泛的意义上讲，该研究为理解 E3 连接酶的底物特异性提供了新范式，揭示了蛋白质泛素化调控中序列多样性与功能保守性的辩证关系，对开发基于泛素化机制的疾病治疗策略具有重要指导意义。