编辑推荐：
为解决 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗肺癌存在的免疫逃逸问题，研究人员开展 αPD-L1×αCD3 蛋白结合剂（BIPE）联合吉西他滨的研究。发现 BIPE 可增强 T 细胞杀伤活性，联合吉西他滨效果更佳，为 NSCLC 免疫治疗提供新策略。
肺癌作为全球发病率和死亡率位居前列的恶性肿瘤，给人类健康带来巨大威胁。在肺癌中，非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的类型，约 70% 的泰国肺癌患者确诊时已处于晚期。目前，PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂虽已获批用于肺癌治疗，但许多患者会因免疫逃逸机制出现疾病复发，亟需新的治疗策略来增强免疫检查点阻断的效果。
为了克服现有治疗的局限性，来自泰国 Phayao 大学等机构的研究人员开展了一项关于 αPD-L1×αCD3 蛋白结合剂（BIPE）联合吉西他滨治疗 NSCLC 的研究。该研究旨在探索如何通过新型生物制剂与化疗药物的联合应用，提升 T 细胞对肺癌细胞的杀伤能力，为 NSCLC 患者提供更有效的治疗选择。研究成果发表在《Biomedicine》上。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 细胞培养与样本制备：培养 A549、NCI-H460、NCI-H1975 等 NSCLC 细胞系，从健康 donors 分离外周血单个核细胞（PBMCs）用于后续实验。
- 流式细胞术：检测 PD-L1 和 MHCⅠ 类分子的表达水平，分析 BIPE 与 CD3+T 细胞及 PD-L1 + 癌细胞的结合能力，评估 T 细胞增殖和活化标志物的表达。
- 细胞共培养与细胞毒性测定：将 BIPE 武装的 T 细胞（BATs）与肺癌细胞共培养，通过 crystal violet 染色和实时活细胞成像系统评估细胞杀伤活性。
- 细胞因子检测：利用细胞因子珠阵列检测共培养上清中 IFN-γ、颗粒酶 B 等细胞因子和溶细胞分子的水平。
3.1 PD-L1 表面表达在肺癌细胞系
通过流式细胞术检测发现，不同 NSCLC 细胞系中 PD-L1 表达水平存在差异。NCI-H1975 细胞 PD-L1 表达最高（阳性率 90.73%±0.40%，平均荧光强度 31654±324），其次为 NCI-H460（55.83%±1.13%，30323±954），A549 最低（10.21%±1.63%，5547±946），表明 PD-L1 表达在 NSCLC 中具有异质性。
3.2 αPD-L1×αCD3 BIPE 的制备与结合亲和力
利用 HEK293T 细胞系统成功制备重组 BIPE，其分子量约为 55 kDa。流式细胞术显示，BIPE 可特异性结合 CD3+T 细胞（结合率 78.28%±0.66%）和 PD-L1 + 的 KKU-213A 细胞（89.45%±1.47%），而与 CD3 - 或 PD-L1 - 细胞结合极少，证实了其靶向结合能力。
3.3 BIPE 促进 T 细胞增殖和活化
CFSE 增殖实验表明，BIPE 可显著促进 T 细胞增殖，且呈剂量和时间依赖性。100 pg 的 BIPE 处理 7 天，T 细胞增殖率达 86.75%±4.76%，显著高于对照组（43.83%±10.32%）。同时，T 细胞活化标志物 CD25 和 CD69 的表达显著升高，分别达 93.83%±1.98% 和 71.27%±10.11%，表明 BIPE 能有效激活 T 细胞。
3.4 BATs 对肺癌细胞的杀伤活性
BATs 与肺癌细胞共培养实验显示，其对 PD-L1 高表达的 NCI-H1975 和 NCI-H460 细胞杀伤效果显著。在 E:T 比例为 10:1 时，NCI-H1975 细胞存活率降至 37.43%±13.49%，NCI-H460 降至 53.40%±12.78%，而对 PD-L1 低表达的 A549 细胞杀伤效果较弱，提示 BIPE 的杀伤活性与 PD-L1 表达水平正相关。
3.5 吉西他滨上调 PD-L1 表达
吉西他滨处理可显著上调肺癌细胞 PD-L1 和 MHCⅠ 类分子表达。0.5 μM 吉西他滨处理 24 小时后，A549 细胞 PD-L1 平均荧光强度从 5128±86.94 升至 7040±126.80，NCI-H1975 升至 144450±8417，同时 MHCⅠ 类分子表达也升高，可能增强肿瘤细胞对 T 细胞的抗原呈递。
3.6 BIPE 联合吉西他滨增强抗肿瘤活性
联合应用 BATs 与吉西他滨时，肺癌细胞存活率显著低于单药处理。在 A549 细胞中，2.5:1 的 E:T 比例下，联合处理存活率为 33.12%±2.38%，显著低于 BATs 单药（96.11%±2.45%）和吉西他滨单药（70.72%±0.93%），表明两者具有协同抗肿瘤效应。
3.7 细胞因子分泌
共培养上清液中，BATs 处理组 IFN-γ 和颗粒酶 B 水平显著高于单纯 T 细胞组，提示 BIPE 通过增强 T 细胞的细胞毒性分子分泌发挥作用。吉西他滨联合处理未显著改变细胞因子水平，但进一步证实了 BATs 的活化效应。
研究结论与讨论
本研究表明，αPD-L1×αCD3 BIPE 可通过靶向结合 PD-L1 + 肿瘤细胞和 CD3+T 细胞，有效增强 T 细胞的增殖、活化和杀伤能力，且与吉西他滨联合应用时，通过吉西他滨诱导的 PD-L1 和 MHCⅠ 类分子上调，进一步提升抗肿瘤效果。这一联合治疗策略为克服 PD-1/PD-L1 抑制剂的耐药性、改善 NSCLC 患者预后提供了新的思路和实验依据。
值得注意的是，研究中发现 EGFR 突变的 NSCLC 细胞系（如 NCI-H1975、NCI-H460）对吉西他滨和 BIPE 联合治疗更敏感，这可能与 EGFR 突变导致的 PD-L1 调控机制有关，为针对特定分子特征的个体化治疗提供了方向。未来需进一步在动物模型和临床研究中验证该联合疗法的安全性和有效性，以推动其向临床转化。
