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为解决现有镇痛药使用受限及副作用问题，研究人员从马氏正钳蝎毒液防御素 4 中，通过计算生物学等方法设计合成 9 氨基酸环肽 Buthicyclin。实验表明其镇痛效果优于吗啡且无毒，为新型镇痛药开发提供候选。
疼痛作为一种与实际或潜在组织损伤相关的不愉快感觉和情感体验，严重影响着人们的生活质量，可引发焦虑、压力、失眠等多种问题。目前常用的镇痛药如非甾体抗炎药（NSAIDs）和阿片类药物（如吗啡）虽有一定疗效，但都存在明显局限性。非甾体抗炎药可能导致出血、免疫抑制和胃刺激等并发症，限制了用药剂量和疗程；阿片类药物则存在中枢神经系统副作用（如镇静、混乱、成瘾）和内脏副作用（如肠梗阻、尿潴留、便秘等），且易产生耐受性和依赖性，不能作为一线治疗药物。因此，寻找新型、高效、低毒的镇痛药具有重要的医学意义和临床需求。
在这样的背景下，伊朗塞姆南医科大学（Semnan University of Medical Sciences）的研究人员开展了从蝎毒中开发新型镇痛肽的研究。他们的研究成果发表在《Biomedicine》上，为镇痛药物的研发提供了新的方向。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先运用计算生物学方法，包括分子对接模拟、分子动力学分析以及基于多种机器学习算法的理化和生物学特性预测，从马氏正钳蝎（Mesobuthus martensii Karsch）毒液的防御素 4（Defensin 4）中筛选出潜在的镇痛肽片段；然后通过固相合成法合成环状肽，并利用圆二色性（CD）光谱确定其二级结构；接着通过 MTT 法、溶血试验和半数致死量（LD50）测定评估肽的毒性；最后通过 Tail-flick 试验、Hot plate 试验和 Formalin 诱导舔爪试验等动物模型评价其镇痛效果，并探究其作用机制。
3.1 BmKDfsin4 蛋白序列检索及阿片受体三维结构获取
从 UniProt 数据库获取了马氏正钳蝎毒液中含 62 个残基的 Defensin 4（BmKDfsin4）蛋白的 FASTA 格式序列，从 RCSB PDB 服务器获取了人类 Mu、Kappa 和 Delta 型阿片受体的 PDB 格式三维结构。
3.2 BmKDfsin4 三维结构的从头模拟
去除 BmKDfsin4 的信号肽（残基 1-24）后，利用 PepFold4 进行三维结构模拟，通过 ProSA-Web 和 PROCHECK 服务器验证模型，筛选出最佳模型用于分子对接模拟，同时通过 RaptorX Property 服务器分析其二级结构和溶剂可及性。
3.3 配体结合位点预测
对阿片受体结构进行清洗处理，利用 CASTp 和 PrankWeb 服务器分别预测 Mu、Kappa 和 Delta 型阿片受体的配体结合口袋和位点，获取相关结构信息。
3.4 从 BmKDfsin4 中发现肽段并表征
通过分子对接模拟，从 BmKDfsin4 中筛选出两个截断肽段，经分析结合能（?G）和 dissociation constant（Kd），选定 9 氨基酸的肽段 2（Buthicyclin）。预测其理化和生物学特性，显示其具有适宜的性质。
3.5 Buthicyclin 与 Mu、Kappa 和 Delta 阿片受体的相互作用评估
利用 Cluspro 软件进行分子对接，PRODIGY 软件分析结合能和亲和力，LigPlot + v.1.4.5 评估肽 - 受体相互作用，证实 Buthicyclin 能与这些受体正确结合。
3.6 分子动力学模拟
通过 GROMACS 2018 软件包和 OPLS-AA 力场进行分子动力学模拟，计算均方根波动（RMSF）、均方根距离（RMSD）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）等参数，评估 Buthicyclin 与阿片受体复合物的稳定性。
3.7 肽合成与表征
采用 Fmoc 固相合成法合成 Buthicyclin，通过 RP-HPLC 纯化至 95% 以上，利用 Sciex API100 LC/MS 质谱仪确认分子质量和序列准确性。
3.8 Buthicyclin 二级结构研究
通过 Jasco J-810 光谱仪进行圆二色性光谱分析，显示 Buthicyclin 具有螺旋状结构，证实了 PepFold4 的结构预测。
3.9 Buthicyclin 的细胞毒性和 LD50
溶血试验显示 Buthicyclin 在最高浓度（4000 μg/ml）时溶血活性为 3.26%；MTT 试验表明其在最大浓度（1000 μg/ml）时对细胞毒性低于 5%；LD50值大于 20 mg/kg，显示其低毒性。
3.10 Tail-flick 试验结果
Two-way ANOVA 分析显示，Buthicyclin 能显著延长小鼠的反应时间，且呈剂量和时间依赖性，在 180 和 360 min 时仍有明显效果，镇痛效果优于 2 mg/kg 的吗啡。
3.11 Hot plate 试验结果
试验表明 Buthicyclin 能显著提高小鼠的反应时间，2 mg/kg 剂量的 Buthicyclin 在 60-180 min 时的峰值反应时间明显长于吗啡，且 1 mg/kg 剂量在 180-360 min 时的效果也优于吗啡。
3.12 Formalin 诱导舔爪试验结果
Buthicyclin 在急性和炎症疼痛阶段均能减少小鼠舔爪时间，尤其在炎症阶段效果显著优于吗啡。
3.13 镇痛机制评估
通过 Hot plate 试验结合纳洛酮（naloxone，阿片受体拮抗剂）处理，发现纳洛酮能逆转 Buthicyclin 的镇痛效果，证实其通过阿片受体发挥作用。
综上所述，本研究从马氏正钳蝎毒液防御素 4 中成功鉴定并设计出新型环肽 Buthicyclin。该肽具有显著的镇痛效果，在急性和炎症疼痛模型中均表现出比吗啡更强且更持久的镇痛作用，同时具有低毒性和良好的安全性。其镇痛机制是通过与阿片受体结合实现的。尽管该研究为新型镇痛药的开发提供了极具潜力的候选分子，但仍需进一步的临床前和临床试验来验证其安全性和有效性。这项研究不仅拓展了蝎毒在医药领域的应用，也为解决现有镇痛药的局限性提供了新的思路和方向，在镇痛药物研发领域具有重要的科学意义和应用前景。
