编辑推荐：
该综述聚焦工业真菌高通量筛选难题，介绍微滴微流控技术（DMFS）优势，涵盖微流控芯片、液滴生成调控及多模态检测等关键技术，分析丝状真菌液滴破裂解决方案，展望 AI 自动化与无标记检测等发展方向，助力高效筛选与可持续生物制造。
工业真菌在生物制造中至关重要，其通过基因改造提升生产力，但传统筛选方法在通量和灵敏度上存在局限。微滴微流控技术（DMFS）作为新兴手段，为工业真菌高通量筛选带来突破。
工业真菌的应用与挑战
工业真菌作为真核微生物，无叶绿体但具细胞核与细胞器，经选育和改造后，因生长周期短、代谢途径多样，成为生物制造的理想底盘细胞。其在医药、生物化学、纺织、食品、环境工程等领域应用广泛：酵母用于酿酒及生产乙醇、脂肪酸、酯类；霉菌用于发酵生产工业酶、有机酸、抗生素等。通过生物设计、基因组编辑结合组学、分子遗传学及代谢工程技术，工业真菌改造取得显著进展，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）经改造可高效生产重组 α- 淀粉酶，裂殖壶菌（Schizochytrium）基因工程实现二十二碳六烯酸（DHA）等有价值油脂的有效生物合成。然而，工业真菌在生物制造中面临遗传背景复杂、分子工具缺乏、改造效率低及代谢通路认知不全等挑战，制约了合理改造工程的有效性。
随机诱变因方法简单、适用广泛，可快速生成多样突变库，即便在分子机制不完全明确时也能获得具有理想性状的菌株，但因其非靶向性和随机性，正突变率较低，故需结合高通量技术提升筛选效率。高通量筛选可在短时间内鉴定数千万菌株，常见方法包括琼脂平板筛选、微量滴定板分析、荧光激活细胞分选（FACS）和 DMFS。传统的琼脂平板和微量滴定板筛选通量有限，即便自动化处理，每日也仅能处理数千样本，难以应对大型突变库；FACS 虽每小时可处理数百万细胞，但依赖细胞表面或细胞内标记的荧光信号，检测能力受限，无法直接评估分泌酶或代谢物等关键细胞外产物，且对多核真菌孢子或分支菌丝等复杂结构的样本兼容性差，光散射信号易受干扰，影响分选准确性和特异性。
微滴微流控技术的优势
DMFS 技术通过将单个细胞封装在皮升级液滴中（每个液滴作为独立微反应器），实现原位培养和分析。与 FACS 相比，其分隔性允许直接测量液滴内的细胞内信号和分泌的细胞外产物，检测方式更具多样性，除荧光外，还兼容吸光度、拉曼光谱和质谱，拓宽了可筛选表型的范围。在保持超高通量的同时，液滴形式可最大限度减少交叉污染（平板中可能存在的问题），并为不同细胞类型提供强大的物理 containment。因此，DMFS 有效解决了其他高通量筛选方法的关键不足，在细菌、酵母和丝状真菌筛选中价值日益凸显。不过，将 DMFS 应用于工业真菌时，面临菌丝生长和蒸发等导致的液滴不稳定问题。
微滴微流控平台的技术构成
微流控技术是在微尺度通道内对流体进行操作和控制，具有分析时间短、样品和试剂消耗少、操作精度高等优点。在 droplet microfluidics 中，利用连续相的流体剪切力破坏分散相的表面张力，形成纳升甚至皮升大小的液滴，每个液滴可作为独立的反应单元。
微滴微流控筛选平台的架构包括微流控芯片、液滴生成与操纵技术以及菌株封装。微流控芯片是平台的核心，其设计和制造工艺直接影响液滴生成的稳定性和筛选效率；液滴生成与调控技术通过精确控制流体参数，实现液滴大小、生成频率的精准调节；菌株封装则是将工业真菌的孢子或细胞准确地包裹在液滴中，确保每个液滴内仅有单个细胞或孢子，为后续的单细胞分析奠定基础。
液滴检测基于多种信号模式，包括荧光检测（利用荧光标记物对细胞内特定物质或细胞状态进行标记和检测）、拉曼光谱检测（通过分析细胞或产物的拉曼散射光谱获取化学组成和结构信息）、质谱检测（对液滴内的代谢物、蛋白质等进行质谱分析，实现物质的定性和定量检测）等。这些多模态检测方法结合，可全面、准确地获取工业真菌的相关信息，提升筛选的准确性和效率。
微滴微流控技术在工业真菌筛选中的应用案例
DMFS 在工业真菌高产酶和多种小分子化学品筛选中已有应用。例如，在高产酶菌株筛选中，通过将真菌孢子封装在液滴中，利用液滴内的微环境进行培养，结合多模态检测技术，可快速检测酶的分泌量和活性，从而筛选出高产酶菌株；在小分子化学品筛选方面，可针对特定的小分子代谢产物，设计相应的检测方法，从突变库中高效筛选出能高产目标小分子化学品的菌株。
挑战与未来展望
尽管 DMFS 在工业真菌高通量筛选中展现出显著优势，但仍面临一些挑战。对于丝状真菌，菌丝生长可能导致液滴破裂，影响筛选的稳定性和准确性。目前提出的解决方案包括物理约束（通过微流控芯片结构设计限制菌丝生长）、仿生核壳水凝胶（利用水凝胶的物理特性包裹菌丝，维持液滴稳定）和基因工程方法（对丝状真菌进行基因改造，调控菌丝生长模式）等，以延长稳定培养时间。
未来，DMFS 的发展可能聚焦于跨学科应用，如结合人工智能实现自动化筛选，通过机器学习算法对检测数据进行分析和预测，提高筛选的智能化水平；开发无标记检测方法，避免荧光标记等对细胞的潜在影响，更真实地反映细胞的生理状态和代谢活动。此外，进一步优化微流控芯片设计和液滴生成技术，提升平台的通量和兼容性，也是未来的重要发展方向。
总之，该综述全面探讨了 DMFS 在工业真菌高通量筛选中的应用，为提升工业真菌筛选效率、推动可持续生物制造提供了理论和技术参考。
