甘油与葡萄糖协同优化大肠杆菌重组蛋白生产的诱导条件研究及其在胰岛素前体表达中的应用

本研究针对大肠杆菌pET系统中葡萄糖引发的分解代谢抑制效应，通过比较不同碳源(葡萄糖Glu、甘油Gly及混合GluGly培养基)和IPTG浓度(1/10/100 μM)对胰岛素前体-msGFP2表达的影响，发现10 μM IPTG下GluGly培养基使蛋白产量提升3-4倍，其机制涉及解除葡萄糖诱导的cAMP-CAP抑制并优化TCA循环通量，为低成本高效生产重组蛋白提供新策略。

　　

在生物制药领域，大肠杆菌(Escherichia coli)作为"细胞工厂"长期占据主导地位，其重组蛋白产量约占全球总量的30%。然而使用传统葡萄糖培养基时，高浓度葡萄糖会通过磷酸转移酶系统(PTS)引发分解代谢抑制(catabolite repression)——这种由cAMP(环磷酸腺苷)水平下降导致的分子级联反应，会显著降低依赖lac启动子的pET系统表达效率。更棘手的是，高浓度诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)虽能部分缓解抑制，却会加重细胞代谢负担并增加生产成本。面对胰岛素市场需求持续增长与生产成本控制的矛盾，寻找既能维持细胞活力又能高效表达的培养方案成为行业痛点。

针对这一难题，研究人员开展了碳源优化研究。既往报道显示甘油能避免分解代谢抑制，但其缓慢的代谢特性导致培养周期延长；而葡萄糖-甘油混合培养基虽在自诱导系统中有所应用，但缺乏对不同IPTG浓度下分子机制的系统解析。为此，研究团队选用工程菌株SHuffle T7（具有氧化还原途径优化特性）表达proinsulin-msGFP2融合蛋白，通过设计三组培养基（8 g/L Glu、8 g/L Gly、4 g/L Glu+4 g/L Gly）与三级IPTG浓度梯度（1/10/100 μM），结合qRT-PCR、HPLC代谢分析和Western blot等技术，首次揭示了混合碳源在低IPTG条件下的协同增效机制。

关键技术包括：1）构建pET26b-proinsulin-msGFP2重组质粒并转化SHuffle T7菌株；2）采用限定化学成分培养基进行三组平行培养；3）HPLC监测碳源消耗与有机酸积累；4）通过OD₆₆₀标准化Western blot定量蛋白产量；5）qRT-PCR分析mRNA转录水平变化。

【3.1 不同IPTG浓度下的胰岛素前体生产】
在100 μM IPTG条件下，三种培养基的蛋白产量无显著差异，证实高浓度诱导剂可克服分解代谢抑制。但将IPTG降至10 μM时出现戏剧性变化：GluGly和Gly培养基的蛋白产量达到Glu培养基的3-4倍（p<0.05），且单位细胞产量提升2倍，说明低IPTG时甘油能有效解除葡萄糖抑制。值得注意的是，1 μM IPTG在所有培养基中均无法诱导有效表达，确定了10 μM为最低有效浓度。

【3.2 100 μM IPTG下的生产特性】
高浓度IPTG暴露了甘油代谢的局限性：Gly培养基中细胞生长严重受限（OD₆₆₀仅1.1），且残留6 g/L甘油未被利用。代谢分析显示GluGly组能完全消耗碳源，但有机酸（尤其是乙酸）积累达1 g/L，提示能量代谢失衡可能是抑制细胞生长的关键因素。

【3.3 10 μM IPTG的突破性发现】
降低IPTG浓度显著改善细胞适应性：Gly组最终OD₆₆₀达8.6，较100 μM组提升7.8倍。时序分析揭示GluGly培养基的双阶段优势——前10小时快速消耗葡萄糖（维持生长速率），后5小时高效利用甘油（提升蛋白表达）。特别重要的是，15小时时GluGly组的产量已是Gly组的1.55倍（p<0.05），证明混合碳源能缩短生产周期。

【3.4 分子机制解析】
qRT-PCR显示10 h时GluGly组的mRNA水平是Glu组的3倍，证实甘油代谢解除cAMP-CAP复合物对lac启动子的抑制。代谢组学发现GluGly培养基几乎不积累有机酸，而Glu组的乙酸持续存在，说明混合碳源能平衡糖酵解与TCA循环通量。这种代谢重编程使细胞在维持高生长速率（μ=0.34 h^-1）的同时实现高效翻译。

该研究通过严谨的多组学分析，首次阐明葡萄糖-甘油混合培养基在低IPTG（10 μM）条件下的三大优势：1）时空分离的碳源利用模式（葡萄糖促生长→甘油促表达）；2）解除分解代谢抑制提升转录效率；3）优化代谢流分配减少碳损失。实际生产中，该方案可使胰岛素前体产量提升3-4倍的同时，将诱导剂成本降低90%。研究团队特别指出，GluGly培养基的"双碳源接力"特性对其它易形成包涵体的重组蛋白生产具有普适性参考价值，为生物制药的工艺优化提供了新范式。论文发表在《Biotechnology Reports》的发现也为绿色生物制造（利用生物柴油副产物甘油）开辟了新途径。