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为探究 miRNA 与 cyp19a 关联及在生殖中的作用，研究人员对雌雄青鳉脑进行 RNA 测序，筛选出 54 个差异表达 miRNA。经 qPCR 和双荧光素酶报告实验证实，miR-375-3p 靶向 cyp19a1a和 cyp19a1b，且芳香化酶抑制剂处理可诱导性逆转。该研究为青鳉生殖发育调控机制提供新视角。
在生命科学领域，性别决定与分化机制一直是备受关注的热点话题。对于鱼类而言，其性别决定系统复杂多样，既包含遗传因素（GSD），也受到环境因素（ESD）的影响，而性激素在性腺发育过程中起着关键作用。下丘脑 - 垂体 - 性腺轴（HPG 轴）作为调控内分泌的核心通路，其任一环节的异常都可能导致激素失衡，进而影响生殖功能。然而，垂体如何通过不同层级调控雌雄个体的激素分泌，以及微小 RNA（miRNA）这类非编码 RNA 在其中扮演的角色，仍有许多未解之谜。细胞色素 P450 芳香化酶（CYP19）作为催化雄激素转化为雌激素的关键酶，其编码基因 cyp19a 在硬骨鱼类中分化为 cyp19a1a（主要在卵巢表达）和 cyp19a1b（主要在脑表达），它们在性别分化中的具体调控机制尚未完全明晰。在此背景下，开展对青鳉（Oryzias latipes）脑内性别差异表达 miRNA 的研究，对于揭示 miRNA 通过靶向 cyp19a 调控生殖发育的机制具有重要意义。
为解答上述科学问题，上海海洋大学的研究人员以青鳉 HdrR 品系为实验模型，开展了一系列研究。该研究成果发表在《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，收集成年雌雄青鳉脑样本（各 3 尾），通过形态学观察和性别分子标记 dmy 确认性别；其次，构建小 RNA 文库并进行 Illumina 高通量测序，筛选雌雄脑内差异表达的 miRNA；然后利用 qPCR 验证候选 miRNA 在性别分化过程中的表达差异；通过芳香化酶抑制剂依西美坦（EM）处理诱导性逆转，结合组织学观察和基因表达分析，探究 miRNA 与性别相关基因的关联；最后借助双荧光素酶报告实验验证 miRNA 与 cyp19a1a/cyp19a1b的靶向结合关系。
样本收集与测序分析
研究选取上海海洋大学养殖的青鳉 HdrR 品系，在特定光照（8:00-22:00）和水温（26±2℃）条件下饲养，每日投喂卤虫三次。通过形态学观察和 dmy 分子标记确认性别后，收集成年雌雄个体脑样本（各 3 尾）用于后续分析。构建小 RNA 文库并测序后，从雌性和雄性脑样本中分别获得 9,802,297 和 13,092,735 条独特序列，经过滤分类后进行差异表达分析。
差异表达 miRNA 筛选
RNA 测序结果显示，雌雄青鳉脑内共有 54 个 miRNA 呈显著差异表达，其中 45 个偏向雌性表达，9 个偏向雄性表达。qPCR 验证表明，随着性别分化进程，候选 miRNA（如 miR-375-3p）的表达水平在雌雄个体间差异显著，提示这些 miRNA 可能参与性别分化调控。
EM 处理诱导性逆转
对青鳉进行 EM 处理后，组织学观察发现卵巢出现退化和空泡化，呈现雄性特征，表明 EM 成功诱导了雌性向雄性的性逆转。qPCR 分析显示，与对照组相比，处理组中雌性发育相关基因（foxl2、cyp19a1a、cyp19a1b）表达下调，而雄性发育相关基因（dmy、cyp17a、gsdf）表达上调，同时部分 miRNA 表达水平升高，暗示 miRNA 可能通过调控这些基因参与性别表型转换。
靶向验证：miR-375-3p 与 cyp19a 的结合
双荧光素酶报告实验证实，miR-375-3p 可特异性结合 cyp19a1a和 cyp19a1b的 3'UTR 区域，表明其通过直接靶向这两个基因调控芳香化酶表达，进而影响雌激素合成和性腺发育。
研究结论表明，青鳉雌雄脑内存在显著差异表达的 miRNA，其中 miR-375-3p 通过靶向 cyp19a1a和 cyp19a1b参与性腺发育调控。芳香化酶抑制剂处理可通过改变 miRNA 和性别相关基因的表达，诱导性逆转现象。该研究首次在成年青鳉脑中系统分析了性别差异 miRNA 的表达模式，揭示了 miR-375-3p/cyp19a 通路在 HPG 轴调控中的重要作用，为理解硬骨鱼类性别分化的分子机制提供了新靶点，也为 miRNA 在生殖发育调控中的功能研究拓展了思路。此外，研究结果对水产养殖中性别控制技术的开发具有潜在指导意义，有助于深入解析环境因素与遗传因素互作下的生殖调控网络。
