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本综述聚焦肺纤维化，探讨机械感知通路在其进展中的作用。介绍特发性肺纤维化（IPF）现状，分析整合素、ROCK、DDR、TRP 等通路及 YAP/TAZ 转录因子的机制，还综述了多种研究模型，为抗纤维化治疗提供方向。
摘要
纤维化疾病以细胞外基质（ECM）成分过度产生导致组织力学和功能改变为特征。肺纤维化发病时机械感知改变被认为形成正反馈循环促进疾病进展，但致纤维化组织重塑与稳态组织重塑的确切机制仍未知。创新实验室模型推动了致病机械感知的机制研究并确定新抗纤维化候选药物。本综述涵盖近 5 年探讨促成肺纤维化发展的机械转导通路及推动该领域发展的创新实验室模型的相关研究。
引言
特发性肺纤维化（IPF）是最致命的纤维化疾病之一，好发于老年男性（中位年龄 66 岁），诊断后中位生存期 2.5-3.5 年，患者最终因器官衰竭死亡。高分辨率 CT 扫描可见 “蜂窝状” 瘢痕。目前认为，上皮细胞反复损伤引发未及时 resolving 的伤口愈合反应是重要起始因素，成纤维细胞灶（富含 ECM 蛋白、成纤维细胞和肌成纤维细胞）与患者预后不良相关。IPF 进展涉及多种因素，包括基底细胞和肺泡 Ⅱ 型上皮细胞（AEC2）修复受损肺上皮能力受损、转化生长因子 -β（TGF-β）介导成纤维细胞向表达 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的收缩性肌成纤维细胞分化等。现有抗纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布只能减缓 IPF 进展，无法阻止或逆转肺纤维化。靶向机械感知通路的治疗候选药物在临床前研究中显示出前景，多项评估对机械感知通路和基质重塑有直接或间接作用药物的临床试验正在进行中。
肺组织经历周期性机械牵张，影响蛋白质、细胞和组织层面的功能。机械感知是复杂过程，涉及应变依赖的细胞外（如纤连蛋白）和细胞内（如黏着斑蛋白）蛋白质隐蔽结合位点等。肺纤维化发展过程中肺的机械特性（如硬度、顺应性和强度）改变，影响上述信号通路，细胞外基质的组成变化也可激活驱动纤维化进展的致病信号通路。单细胞 RNA 测序和空间转录组学研究显示，IPF 患者样本中多种细胞类型的机械感知（如 TRPV4、DDR2、ROCK1、PTK2）、黏附（如 ITGA2、ITGAV 等）和 ECM（如 COL1A1、COL3A1 等）基因失调。
整合素家族与机械转导
整合素是将肌动蛋白细胞骨架与胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质成分连接的异二聚跨膜受体。激活的整合素聚集形成新生黏附，成熟为更大的黏着斑，是机械转导的主要位点，促进双向力信号传导。αv 整合素（如 αvβ1、αvβ6 和 αvβ8）结合细胞外基质中储存的潜伏 TGF-β 的精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（RGD）基序，介导成纤维细胞、上皮细胞和免疫细胞释放活性 TGF-β，活性 TGF-β 通过 Smad、MAPK 和 ERK 通路促进肌成纤维细胞分化和纤维化。αvβ6 介导的活性 TGF-β 释放需要肌动蛋白细胞骨架产生的力，而 αvβ8 可通过与附近细胞上的潜伏 TGF-β/GARP 复合物结合，以不依赖细胞骨架的方式激活 TGF-β。针对 αv 整合素的单克隆抗体已被开发用于治疗 IPF，BG00011（αvβ6 特异性抗体）的 II 期临床研究因安全问题终止，而小分子 αvβ6 和 αvβ1 双重抑制剂贝索特格拉斯特仍在临床评估中（II 期）。
除 αv 整合素外，胶原结合整合素（如 α1β1、α2β1、α10β1）和白细胞特异性整合素（如 αMβ2 等）在肺纤维化发展中的作用也受到关注。Ⅰ 型胶原条件性敲除小鼠在肺部给予博来霉素后表达持续至第 14 天的凋亡标志物，生存率降低。成纤维细胞中 α2 整合素缺失减少羟脯氨酸含量，而肺泡上皮细胞中 α2 整合素缺失增加羟脯氨酸含量和凋亡标志物，表明特定胶原结合整合素的促纤维化和促再生作用取决于表达的细胞类型。αM 整合素在 IPF 巨噬细胞中上调，促进与体外肺模型的黏附，导致成纤维细胞 / 肌成纤维细胞 α-SMA 表达和收缩性增加。吡非尼酮处理的 CD206?巨噬细胞表现出形态和黏附改变，归因于 αM 和 β2 整合素下调，从而抑制纤维化。
黏着斑蛋白与细胞骨架调控
多种黏着斑蛋白将肌动蛋白细胞骨架与整合素连接，共同在调节细胞形态、收缩性和迁移中起关键作用。从 IPF 患者分离的成纤维细胞具有比健康对照更硬的细胞骨架，导致纤维化组织整体硬度增加。TGF-β 处理增加健康和患病成纤维细胞的细胞硬度，这归因于向肌成纤维细胞表型转变期间 α-SMA 掺入应力纤维。RhoA 调节肌动蛋白聚合，RhoA 下游的 Rho 相关卷曲螺旋蛋白（ROCK）1 和 2 激活肌球蛋白调节轻链（RLC），允许产生收缩力。ROCK1?/?、ROCK2?/?和 ROCK1?/?2?/?小鼠在博来霉素肺损伤后表现出上皮细胞凋亡、血管通透性和成纤维细胞对 TGF-β 敏感性降低，总体改善羟脯氨酸含量和体重减轻。RhoA 和 ROCK1 也被认为在白细胞迁移和黏附中起作用，CD4?和 CD8?T 细胞迁移减少与 RhoA 和 ROCK1 活性降低相关。ROCK2 活性介导体外 M2 巨噬细胞黏附，通过 WXWH0265 抑制 ROCK 可减少博来霉素诱导的肺损伤后 M2 巨噬细胞浸润。溶血磷脂酸（LPA）是自分泌运动因子产生的生物活性磷脂，调节 ROCK 活性，LPA 受体和自分泌运动因子抑制剂正在临床评估用于治疗 IPF（如 BMS-986278 和 GLPG1690）。
RhoA 激活心肌素相关转录因子（MRTF）和血清反应因子（SRF），驱动 ACTA2（编码 α-SMA 的基因）表达。多个研究组显示，在博来霉素或矽肺肺损伤模型中抑制 MRTF-A 可减少纤维化。肌动蛋白调节蛋白（Arp）2/3 复合物驱动分支肌动蛋白聚合，也调节 MRTF 和 TGF-β 刺激的 α-SMA 表达。α-SMA 被招募到肌动蛋白应力纤维，促进肌成纤维细胞的力产生和收缩性。肌动蛋白结合蛋白如钙调蛋白 1 与 α-SMA 阳性应力纤维共定位，在间皮向间充质转化（MesoMT）期间促进 α-SMA 的招募。钙调蛋白 1 siRNA 敲低减少应力纤维形成、黏着斑、牵引力，并增加细胞迁移。
肺泡 Ⅱ 型上皮细胞（AEC2）向肺泡 Ⅰ 型上皮细胞（AEC1）的转变也包括部分由 Cdc42 介导的肌动蛋白细胞骨架组织变化。Cdc42 敲除小鼠在肺叶切除后 AEC2 细胞分化为 AEC1 细胞的能力受损，导致肌成纤维细胞增殖和羟脯氨酸含量增加，伴随肺功能（如 SaO?、用力肺活量和顺应性）下降。Cdc42 敲除小鼠随年龄增长还会发展为自发性肺纤维化。切除后植入减少机械张力的硅胶假体可减少羟脯氨酸和促纤维化基因的表达。
盘状结构域受体（DDR）
盘状结构域受体（DDR）1 和 2 是结合胶原并支持胶原介导的黏附、迁移和基质重塑的受体酪氨酸激酶。尼达尼布以剂量依赖方式减少 DDR2 的磷酸化，表明尼达尼布的疗效可能部分归因于 DDR 抑制。比尼达尼布对 DDR1/DDR2 特异性更高的抑制剂在博来霉素诱导的肺损伤模型中也显示出抗纤维化作用。更具体地说，DDR1 抑制剂 DDR1-IN-1 和 DDR1-IN-2 改善死亡率和纤维化基因（如 Col1a1、Acta2、Fn1）的表达，这归因于巨噬细胞浸润和炎症小体激活标志物（IL-1β 和 Casp-1）的减少。DDR2 抑制剂 WRG-28 在体内减少肺羟脯氨酸含量，归因于肺成纤维细胞对 Fas 介导的凋亡敏感性增加和 DDR2 介导的 Ⅰ 型胶原合成减少。这些发现支持 DDR 介导的胶原信号参与炎症和纤维化反应。
瞬时受体电位（TRP）通道和 Piezo 通道
瞬时受体电位（TRP）通道和 Piezo 通道由机械刺激激活，促进钙和钠离子的转运，对细胞激活、迁移和 ECM 重塑有下游影响。在 IPF 肺中，TRPV4 与 E - 钙粘蛋白和表面活性蛋白 - A 在 α-SMA 阳性细胞中共定位。在小鼠肺纤维化模型中，口服 TRPV4 拮抗剂对组织学纤维化评分、血清 TGF-β 和羟脯氨酸含量的影响与吡非尼酮治疗相似。在培养模型中，吡非尼酮减少 TRPV4 介导的上皮细胞迁移、IL-8 产生和肺成纤维细胞 α-SMA 表达。
在静态拉伸条件下循环应变培养的肺成纤维细胞增加 Piezo1 和 Piezo2 通道表达以及由 Piezo1/ERK 信号驱动的纤维化标志物。TGF-β 已被证明增加 Piezo1 表达和钙内流。同样，Piezo1 敲低减少 TGF-β 水平，表明 Piezo1 和 TGF-β 之间可能存在驱动上皮 - 间充质转化（EMT）的正反馈循环。Piezo1 定位于多种细胞类型的黏着斑，有助于钙依赖性黏着斑解体。Piezo1 抑制也已被证明损害人 CD4?T 细胞的趋化性。
YAP/TAZ 转录因子
Yes1 相关转录调节因子（YAP）和含 PDZ 结合基序的转录共激活因子（TAZ）是机械敏感转录因子，在细胞核中积累，与包括 TEA 结构域家族成员（TEADs）在内的转录因子相互作用，调节多种促纤维化基因的表达。YAP1 基因表达和 YAP 核积累在纤维化肺中改变。体外拉伸胎儿肺组织通过 ROCK-YAP/TAZ 信号增加肺泡 Ⅰ 型细胞的百分比。YAP 条件性敲除小鼠在博来霉素诱导的肺损伤后增加纤维化相关基因和羟脯氨酸含量。YAP-cKO 小鼠的 AEC2 细胞表现出增殖减少和分化为 AEC1 细胞的能力受损，阻碍博来霉素给药后的肺泡再生。有趣的是，Sun 等人在肺泡球 AEC 中未检测到 YAP，而是在 AEC1 细胞中观察到 TAZ 核积累，而 AEC2 细胞中没有。成纤维细胞中的 YAP 信号也被认为在肺纤维化进展中起作用。肺成纤维细胞中 YAP1 过表达增加 Ⅰ 型胶原 α1 和 Ⅲ 型胶原 α1 的 mRNA 水平，YAP1 敲低减少 TGF-β 驱动的成纤维细胞增殖、迁移和向肌成纤维细胞的分化。在评估纤维化中的 YAP/TAZ 信号时，重要的是要考虑其与其他纤维化信号通路（包括 TGF-β/SMAD 和 WNT/β- 连环蛋白通路）的汇聚。评估 YAP 核质比、TEAD 转录因子活性和靶基因将更好地理解 IPF 发展过程中机械和生化信号如何整合。
细胞外基质交联与纤维化
ECM 蛋白的沉积增加和交联增加均导致肺纤维化中观察到的硬度和顺应性变化。交联给 “逆转” 纤维化带来挑战，因为高度交联的蛋白质更难通过蛋白水解降解清除。ECM 蛋白通过酶促和氧化过程交联，改变 ECM 的拓扑结构和硬度。赖氨酰氧化酶（LOX）和赖氨酰氧化酶样（LOXL）1 至 4 催化细胞外胶原交联。LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3 和 LOXL4 基因的表达在 IPF 中均上调，并在多种细胞类型中发现。Simtuzumab 是一种抑制 LOXL2 酶功能的单克隆抗体，曾被评估为 IPF 的潜在治疗药物（NCT017769196）。尽管最初的小鼠模型显示出有希望的结果，但 II 期临床试验因缺乏疗效而终止，部分原因是靶向不足。最近的研究表明，与 LOXL2 条件性敲除小鼠中观察到的最小改善相比，LOXL4 条件性敲除小鼠在博来霉素诱导的肺损伤后表现出二价交联减少、羟脯氨酸含量、组织学评分和纤维化基因减少。这些研究还强调了模型选择的重要性，因为 LOXL2 在博来霉素诱导的损伤中似乎是一个有希望的靶点，但在更复杂的人源化肺纤维化小鼠模型中改善甚微。转谷氨酰胺酶 2（TG2）是另一种参与交联的酶。TG2 在 TGF-β 处理的成纤维细胞中上调，外源性 TG2 上调 TGF-β，形成正反馈循环。
在 H?O?存在下，酪氨酸氧化形成二酪氨酸（DT）交联。几种 ECM 蛋白含有易受 DT 交联影响的酪氨酸残基，IPF 肺组织中 DT 交联增加。TGF-β 刺激的成纤维细胞增加细胞外 H?O?和高分子量纤连蛋白的分泌，表明存在 DT 交联的纤连蛋白，这导致成纤维细胞迁移减少。
纤维化研究的实验室模型
已采用多种生物学模型和技术来研究纤维化疾病的发生和进展。这些模型通常分析 ECM 产生、组织和硬度的变化，以研究纤维化组织重塑和 / 或筛选抗纤维化疗法。机械刺激可纳入以下描述的模型中，以重现呼吸过程中经历的应变、硬度、压缩和剪切力，以及纤维化进展期间这些力的改变。尽管体内模型仍然是评估抗纤维化候选药物的关键阶段，但调节和测量机械刺激的能力比离体或体外模型更有限。最终，应结合这些技术来理解细胞和组织层面的变化。
气管内递送博来霉素、异硫氰酸荧光素或二氧化硅、照射和转基因小鼠已被用于诱导肺损伤和纤维化。由于小鼠具有比人类更高的再生能力，许多依赖暴露于纤维化剂的方法诱导急性反应。老年小鼠、重复给药和转基因小鼠已被用于生成慢性纤维化模型，但成本更高且更耗时。有多种商业可用的选项，使用强迫振荡技术（FOT）在单个时间点测量肺阻力、顺应性、组织阻尼、用力呼气量和用力肺活量。此外，D’Amico 等人开发了一种通过基于传播的相衬显微计算机断层扫描（PBI-micro CT）分析石蜡包埋组织中的小鼠肺的流程，以评估组织的大体形态特征、指导切片，并将原子力显微镜（AFM）硬度测量与组织学染色空间相关联。这种方法有助于对特定感兴趣区域进行 AFM 测量，尽管仍限于单个时间点。为了评估随时间的动态变化，可以使用经口气管插管方法代替 FOT，但这些程序技术难度大，死亡率增加。非侵入性成像技术，包括显微计算机断层扫描（μCT）和磁共振成像（MRE），已应用于小型和大型动物模型，然而，μCT 成像期间的辐射暴露可诱导癌症，小型动物的尺寸和快速呼吸速率可增加实验复杂性和所需的专用设备。
精密切割肺切片（PCLS）是来自人或动物来源的薄组织切片，可以培养数周。与其他模型相比，PCLS 在其天然细胞外基质中整合了所有细胞类型。几个研究组通过免疫荧光、羟脯氨酸测定、二次谐波生成显微镜评估纤维化基因表达和 ECM 重塑，评估了各种抗纤维化药物候选物。用促纤维化因子（肿瘤坏死因子 -α、TGF-β1、PDGF-AB 和 LPA）混合物培养健康供体的 PCLS，重现了肺纤维化中观察到的上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的基因特征。牵引力显微镜已能够测量支气管 PCLS 对支气管收缩刺激和周期性应力的力反应。该技术可应用于肺纤维化实验，以评估纤维化间质组织内的组织收缩性差异。此外，在收获 PCLS 组织之前，可用琼脂糖膨胀肺，为短期实验提供静态压缩 / 拉伸力。离体小鼠肺组织也可用于评估血管向不同组成和硬度的水凝胶中的 sprouts，以研究肺纤维化中观察到的失调血管生成。
纤维增生和 “瓶中瘢痕” 模型允许快速体外筛选抗纤维化疗法。这些二维模型将与胶原合成相关的可溶性因子（如 TGF-β1 和 L - 抗坏血酸）整合到汇合的成纤维细胞培养物中。更复杂的纤维增生三维模型已被开发，包括包裹成纤维细胞的纤维蛋白微凝胶，其直径和不透明度可随着胶原的沉积和压实而变化。
微制造装置可用于生成微组织，这是一种能够检测收缩性和 ECM 重塑变化的细胞 - 基质模型。使用该技术生成的微组织可用于评估抗纤维化剂和探索力信号通路。Hsia 等人已使用这种中通量模型筛选抗纤维化剂，包括 LPA 受体抑制剂 BMS-986020，该药物在 II 期临床研究中减缓了用力肺活量的下降，但最终因安全问题终止（NCT04308681）。随后评估了 BMS-986020、吡非尼酮和尼达尼布在支柱偏转、α-SMA 应力纤维和前胶原产生方面的变化。此外，Asmani 等人开发了一种改进的微组织阵列，使用真空
