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本文聚焦大脑皮层发育机制，综述放射状胶质祖细胞（RGPs）通过直接 / 间接神经发生生成兴奋性投射神经元及胶质细胞的过程，探讨 RGPs 异质性、细胞类型多样性调控机制及相关疾病关联，为神经发育研究提供重要参考。
引言
大脑皮层是人类最复杂的器官之一，其结构以神经元和神经胶质细胞类型的显著多样性为特征，这些细胞构成了神经元回路。放射状胶质祖细胞（RGPs）按照精确的时间顺序程序，产生所有皮层兴奋性投射神经元和神经胶质细胞类型。皮层兴奋性投射神经元通过直接或通过中间祖细胞（IPs）的间接神经发生产生。然而，在皮层发育过程中如何产生广泛的皮层细胞类型多样性仍然是一个基本的开放性问题。RGPs 如何在数量和质量上产生所有新皮层神经元？直接和间接神经发生如何有助于建立神经元和谱系异质性？目前尚不清楚 RGPs 是代表均质和 / 或多能祖细胞群体，还是由异质群体组成。在本综述中，我们将总结最新发现，这些发现有助于深入了解上述关键问题。
新皮层由大量不同的神经元和神经胶质细胞类型组成，这些细胞由放射状胶质祖细胞（RGPs）依次生成，并组织成六个解剖学上不同的层。所有新生的皮层兴奋性投射神经元以由内向外的方式径向迁移穿过发育中的皮层板，因此早期出生的神经元位于较低层，而晚期出生的神经元位于成熟皮层板内的更上层。新皮层的六层结构是回路组装和大脑功能的基础，包括行为、学习、社交能力、语言、认知和运动技能。
在皮层发育过程中，神经上皮干细胞（NESCs）在脑室区（VZ）对称分裂以扩增其数量。随后，NESCs 分化为 RGPs。在小鼠发育早期，大约胚胎第（E）10-E12 天，RGPs 主要进行对称增殖分裂以扩大其数量。在 E12 时，大多数 RGPs 将其分裂模式转换为不对称分裂，产生新生神经元（神经源性分裂）。RGPs 可以直接或通过中间祖细胞（IPs）间接生成神经元，IPs 迁移至脑室下区并进行基底分裂以生成两个神经元。完成神经发生后，RGPs 获得神经胶质发生潜力，并产生星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系。皮层神经发生是一个精确、刻板且时间上精心安排的过程。
近年来，许多研究从定性和定量水平研究了单个 RGPs 的产出，以了解 RGP 谱系进展的原理。特别是具有单细胞分辨率的谱系追踪技术，包括双标记镶嵌分析（MADM）技术，在小鼠新皮层中建立了 RGP 谱系进展的初步定量框架。单个 RGPs 产生约 8-9 个分布在皮层深层和浅层的神经元。神经发生完成后，约 1/6 的 RGPs 生成星形胶质细胞和 / 或少突胶质细胞祖细胞，进而生成成熟的星形胶质细胞和少突胶质细胞。
皮层发育的破坏，包括神经元的异常生成、神经元迁移和回路组装的缺陷，是许多神经系统和神经发育障碍的主要潜在病因，如癫痫、自闭症谱系障碍和一般皮层畸形。因此，皮层发育的每一步都必须得到良好的调节和执行，以最终确保正常的大脑功能。然而，我们对指导皮层个体发生的关键分子和细胞机制仍缺乏完整的了解。在本综述中，我们将重点关注最近揭示指导发育中新皮层兴奋性投射神经元细胞类型多样性产生的细胞和分子机制的研究。
生成发育中大脑皮层的细胞类型多样性
大脑皮层由数十种兴奋性投射神经元细胞类型组成。虽然细胞类型的定义需要多个标准，但皮层投射神经元可以根据层位、转录组 / 表观遗传特征、电生理特性和轴突投射进行分类。许多 recent studies 聚焦于研究神经元多样性与其特性之间的关系，例如采用 Patch-seq 技术揭示空间、电生理、形态和转录组特征；而 MAPseq 和 BARseq 方法则用于破译轴突投射与突触后靶点之间的关系。慢病毒方法，包括 TREX、STICR 和 TrackerSeq，能够基于转录组特征追踪克隆关系。未来，MADM-CloneSeq 和 / 或基于 FISH 的方法与稀疏克隆标记相结合，有望分析定义的克隆相关皮层投射神经元单元内的细胞类型多样性，并保留空间和形态学信息。尽管上述强大的技术允许在群体和克隆水平上更好地理解神经元特性与细胞类型多样性之间的关系，但 RGPs 如何在单个祖细胞水平上精确产生细胞类型多样性仍不清楚。
大量实验数据表明，间接神经发生可能在大脑皮层神经元多样性的建立中起关键作用。有趣的是，Huilgol 等人最近在小鼠中使用一种巧妙的遗传命运映射方法表明，在胚胎发育后期，大多数兴奋性投射神经元由 IPs 产生，尤其是在海马和新皮层中。IPs 似乎不仅在每个特定类别 [端脑内、锥体束和皮质丘脑] 内扩增投射神经元，而且至少在群体水平上基于轴突投射模式使 RGP 衍生的克隆单元多样化。此外，尽管确切的神经元层输出是可变的，但最近的一项研究表明，间接神经发生影响层分布，产生以 L6 为主的神经元输出的克隆。Buchan 等人表明，与其他祖细胞相比，源自 L4 中 IPs 的神经元表现出特定的树突形态，并接受更多的高阶丘脑输入，突出了 IPs 在建立突触连接中的作用。总之，上述发现表明，与同一 RGP 的直接神经发生相比，间接神经发生不仅在整体上扩增神经元输出，而且以偏向的方式产生功能不同的投射神经元类型。然而，IPs 如何产生功能不同的皮层投射神经元类别的程度仍不完全清楚，需要进一步的实验，理想情况下在单细胞水平上进行。更一般地说，上述数据还表明，就时空水平上 IP 产生的速率而言，RGPs 可能构成比以前预期的更多样化的群体。未来在单个 RGP 和克隆水平上的努力可能会提供明确的答案。
在小鼠视觉皮层中，由同一 RGPs 产生的克隆相关神经元倾向于彼此形成突触，并具有相似的生理特性，如偏好方向和方向选择性。有趣的是，克隆相关的 “姐妹” 神经元（源自不对称分裂的 RGP 的克隆单元内）形成垂直和水平突触连接，而克隆相关的 “表亲” 神经元（源自一个分裂周期前对称 RGP 分裂的两个克隆单元之间）主要形成水平突触连接。这些数据表明，克隆关系的水平（“姐妹” 与 “表亲”）对皮层微电路中神经元连接的水平和特异性有重要贡献。在分子水平上，由同一 RGPs 产生的兴奋性神经元表现出特定的原钙粘蛋白（cPCDH）细胞表面分子组合的相似表达模式，这与非克隆相关神经元不同。此外，与其他层的神经元相比，位于同一皮层层的神经元表现出 cPCDH 表达的高度相似性。上述结果揭示了克隆身份、细胞粘附分子表达和生理特性之间的有趣联系。实验数据还表明，克隆相关投射神经元存在一定程度的转录收敛（即 cPCDH 的特异性表达）。然而，其他数据提供的证据表明，具有相似整体转录组谱的皮层兴奋性神经元大多属于不同的谱系，这与克隆相关的 GABA 能神经元表现出截然不同的转录组谱不同。此外，在 RGP 谱系进展的特定步骤中起作用的转录后机制也不能排除。因此，未来的研究不仅要确定克隆相关投射神经元之间转录收敛和发散的精确水平，还要确定表观遗传和转录后特征，以及基因表达通常如何定义甚至指导克隆关系，这将是重要的。
放射状胶质祖细胞的多样性
单个 RGPs 如何在谱系进展过程中产生不同类别的皮层兴奋性投射神经元是一个重要的未解决问题。已建立了两种主要的生物学理论作为最可能的假设：“渐进能力限制模型” 和 “命运限制祖细胞模型”。第一种理论指出，神经元以可预测的方式产生，其中每个 RGP 是多能的，并且有潜力在发育过程中产生所有投射神经元细胞类型。经典和更现代的移植实验支持该模型。还表明，单个 RGPs 具有主要的神经元层输出潜力，50% 的新生神经元最终位于确定的皮层层。然而，相当一部分 RGP 衍生的克隆单元在某些层中缺乏投射神经元（例如，15% 的克隆在第 5 层中缺少神经元），这表明克隆输出在一定程度上是异质的。为了定义克隆异质性的水平，未来需要超越层位，用明确的标准系统评估 RGP 衍生克隆的结构。尽管已经观察到克隆结构的一些差异，但第一个模型假设所有 RGPs 本质上都是多能的。然而，不能排除塑造最终克隆结构的有丝分裂后机制。相反，第二种模型提出，RGP 群体包括不同的类别，其中某些 RGPs 仅产生神经元的受限子集。虽然第二种模型没有得到实验数据的广泛支持，并且仍然存在一定的争议，但最近的命运映射数据为第二种模型提供了一些更多的支持，尽管大多数实验是在群体水平上进行的。
最近采用单细胞测序方法的努力不仅基于转录组特征（t 型）彻底改变了细胞类型的表征，而且通过伪时间和轨迹分析实现了计算机内谱系追踪。基于单细胞测序分析，在小鼠中，RGP 群体显得相对均质，没有强有力的证据表明存在转录上不同类别的 RGPs。然而，来自雪貂的最新数据表明，存在许多转录上不同类别的 RGPs，这似乎与其在 VZ 中的空间位置相关，具体取决于未来的脑回或脑沟是否会出现。然而，雪貂中不同 RGPs 在个体祖细胞水平上是否具有不同的数量和质量特征，其生物学相关性仍有待确定。
值得注意的是，尽管存在细胞变异性，但在统计谱系推断模型中，小鼠的兴奋性投射神经元共享相对相似的时间细胞分化轨迹。此外，根据 scRNA-seq 数据的无偏聚类，皮层投射神经元似乎来自一个共同的祖细胞分支。这些最新结果可能支持小鼠中存在均质祖细胞群体的观点。相比之下，单细胞转录组分析与 TrackerSeq 的结合揭示了雪貂（P1）和人类（GW17-18）中来自不同 RGPs 的祖细胞的三种轨迹，而对先前小鼠数据（E15.5）的重新分析显示单一轨迹。这些数据提出了一种进化策略的可能性，即根据（物种特异性的）成熟皮层大小调整最终的 RGP 输出。然而，需要提到的是，另一项采用小鼠样本更深测序的研究可以定义三种潜在轨迹。尽管不同的转录轨迹可能表明谱系变异，但需要注意的是，投射神经元多样性与特定轨迹没有相关性。
除了人类和雪貂中的多种转录轨迹（这可能在一定程度上构成物种特异性特征）外，有趣的新数据表明，人类 RGPs 表现出甚至更高水平的多能性。实际上，Delgado 等人表明，在人类皮层发育过程中，某些 RGPs 不仅可以产生皮层投射神经元，还可以产生抑制性神经元谱系，最新数据证实了这一概念。根据小鼠的当前数据，这种水平的 RGP 多能性似乎是皮层祖细胞的人类特异性特征。然而，发育中小鼠脑更尾部区域的干细胞龛和 / 或单个 RGPs 也已被证明在产生兴奋性和抑制性神经元方面具有双能性。因此，破译小鼠新皮层 RGPs 与来自不同干细胞龛的 RGPs 之间的共性和差异，以及与人类皮层双能 RGPs 的比较，将是有趣的。
RGP 内在程序和外在信号在 RGP 谱系进展中的相互作用
RGP 谱系进展以及皮层投射神经元多样性的产生被认为受强大的 RGP 内在驱动调节。事实上，经典和最新的体外研究支持这种机制，因为 RGPs 能够即使在组织环境外也能产生大量不同的投射神经元。有趣的是，已描述了 RGPs 在发育过程中的动态基因表达模式，具有随时间变化的特定转录因子基序和网络，并与神经发生期间的神经元类型特异性相关。此外，RGPs 中表观遗传调控的时间胎记和神经元特异性标记显示出连续的表达波，这可能有助于 RGP 谱系进展期间神经元输出的多样性。连续的基因表达程序被认为调节特定的细胞生物学和 / 或代谢状态，进一步指导细胞分裂模式和新生神经元的潜在命运。例如，细胞周期长度的变化已被证明调节 RGP 衍生的 IP 输出和一般神经源性潜力。线粒体相关代谢也影响 RGP 增殖行为，甚至可能以物种特异性方式影响。
最近的研究强调了细胞外信号和其他非细胞自主机制在产生细胞类型多样性中的关键作用。细胞外基质的成分，如 IV 型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和层粘连蛋白，调节神经干细胞分化。此外，其他细胞外信号，如细胞外囊泡，有助于神经祖细胞增殖和 specification，表明这些（和可能其他）非细胞自主机制对于塑造细胞类型多样性也是必不可少的。
有趣的是，尽管体外模型系统概括了 RGP 谱系进展的许多方面，但也观察到了特定皮层投射神经元的相对 RGP 输出分数的某些改变，这意味着关键的龛衍生和 / 或全组织范围因子的本质。关键外在信号的确切性质仍不清楚，但它们可能来自多种来源，包括机械支持细胞、未成熟新生投射神经元、中间神经元、血液或脑脊液。未来的努力应该建立精确的定量体外系统，以能够系统地探测可能影响整体 RGP 输出的各种信号。结合体内数据，这些努力应该提供对 RGP 内在程序和外在信号在调节 RGP 谱系进展中的相互作用的更深入理解，并最终产生皮层细胞类型多样性。
未来展望
近年来，在表征哺乳动物大脑中各种神经元细胞类型方面取得了重大进展，特别是在新皮层方面。先进工具和技术的发展对于揭示皮层发育过程中协调细胞类型多样性的分子和细胞机制至关重要。然而，新皮层中的 RGPs 是否真正具有多能性，或者它们是否以不同的形式存在，仍然是一个悬而未决的问题。需要进一步的研究来阐明发育中大脑皮层中 RGPs 的定性和定量潜力，特别是通过研究单个 RGPs 对神经元细胞类型产生的输出贡献。未来的工作还应该建立精确的定量框架，以便系统地探索影响和调节 RGP 谱系进展的各种信号，如表观遗传调控机制、转录组特征和状态、转录后修饰，尤其是物种特异性差异。最终，深入研究 RGP 谱系进展、多能性和皮层细胞类型多样性的全谱出现的细胞和分子机制是必要的。这些见解不仅将增强我们对一般皮层发育的理解，还将阐明神经发育和神经系统疾病的潜在病因。
