综述：高通量冷冻电子断层成像技术实现微生物内部生命的多尺度可视化

本综述系统阐述了冷冻电子断层成像技术（cryo-ET）的突破性进展，重点介绍其在微生物内部分子机器原位结构解析中的革命性应用。通过自动化样本制备（如Vitrobot）、高通量数据采集（自动化倾转系列采集）及先进算法（如STA）的协同创新，cryo-ET已实现从纳米级到近原子级的多尺度可视化，为细菌III型分泌系统等研究提供了全新视角。

　　

引言
冷冻电子显微镜（cryo-EM）与冷冻电子断层成像（cryo-ET）已成为结构生物学领域的双子星。前者擅长解析纯化大分子的原子结构，后者则能捕捉细胞原位环境中大分子的三维排布。通过倾转样本（-60°至+60°）获取多角度图像并重建为断层图，结合子断层平均（STA）技术，cryo-ET可将微生物内蛋白复合体的分辨率提升至近原子水平。近年来，硬件（如场发射电子枪）与软件（如深度学习去噪算法）的革新，使得细菌III型分泌系统等复杂纳米机器的原位解析成为可能。

冷冻电子断层成像样本制备的突破
样本制备是cryo-ET的“第一公里”。传统的手工 plunge-freezing 已被半自动化设备（如Thermo Fisher的Vitrobot）取代，通过控制湿度、温度及滤纸 blotting 时间，实现更稳定的玻璃态冰包裹。针对厚样本（如真核细胞），聚焦离子束（FIB）铣削技术可精准削薄至200-300 nm，而微流控芯片技术则能快速固定微生物的瞬态状态。

数据采集的革命
现代300 kV场发射电镜配备直接电子探测器（DED）后，单次倾转系列采集时间从24小时缩短至1小时。并行采集系统（如SerialEM）可同时处理多个网格位置，将通量提升10倍。低剂量模式（<100 e^-/?²）结合能量过滤器，有效缓解电子束损伤并增强信噪比（SNR）。

图像处理的智能化跃迁
面对海量数据（单研究可达PB级），基于卷积神经网络（CNN）的算法如IsoNet能有效修复缺失楔形伪影，而无监督聚类方法可自动识别细菌鞭毛马达的构象异构体。云计算平台的引入使得STA处理周期从数月压缩至数天。

未来展望
全流程自动化与AI驱动的实时分析将是下一阶段重点。通过整合FIB-milling机器人、自动装样机（如AutoTEM）与云端GPU集群，cryo-ET有望实现“样本进-结构出”的一站式解析，为抗生素靶点识别等医学研究提供全新工具。