鲤科鱼类卵巢组织冷冻保存技术的优化及茶多酚抗氧化保护机制研究

本研究针对鱼类生殖细胞冷冻保存中卵巢组织（OTC）技术瓶颈，通过优化冷冻保护剂配方（含10% FBS、10% DMSO、6%蔗糖和6% BSA的PBS体系）及梯度脱水/复水程序，在鲫鱼中实现冻融卵巢细胞膜完整性达51.67±0.78%，并成功应用于雅鱼（65.12%）和斑马鱼（44.56%）。创新性发现冷冻诱导的氧化应激（MDA、SOD、CAT水平升高）可通过添加茶多酚（TP）将细胞膜完整性提升至73.82±4.89%，为水生生物遗传资源保存提供了关键技术支撑。

　　

论文解读

在生物多样性保护和水产种质资源管理中，鱼类生殖细胞的冷冻保存技术一直是研究热点。尽管精子冷冻技术已相对成熟，但卵母细胞和卵巢组织（OTC）的冷冻保存仍面临巨大挑战——卵细胞体积大、结构复杂，冷冻过程中冰晶损伤、渗透压应激和氧化应激（Oxidative stress）会导致细胞膜破裂和DNA损伤。这一问题在鲤科鱼类（Cyprinidae）中尤为突出，该科包含2000多种淡水鱼，既有濒危物种如雅鱼（Schizothorax prenanti），也有重要经济物种。如何通过OTC技术保存这些鱼类的母源基因，成为保护遗传多样性和优质种质资源的关键。

西南大学的研究团队在《Cryobiology》发表的研究中，以鲫鱼（Carassius auratus）、斑马鱼（Danio rerio）和雅鱼为模型，建立了一套高效的卵巢组织冷冻保存方案。通过优化冷冻保护剂组合与程序，结合茶多酚（TP）的抗氧化干预，显著提升了冻融卵巢细胞的存活率和功能活性。

关键技术方法
研究采用梯度脱水/复水程序，以细胞膜完整性（PI染色评估）为核心指标，筛选出含10%胎牛血清（FBS）、10%二甲基亚砜（DMSO）、6%蔗糖和6%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液作为最优冷冻培养基。通过检测氧化应激标志物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）水平，证实冷冻诱导的脂质过氧化损伤，并首次在鱼类OTC中添加茶多酚进行干预。实验样本来自市场采购的1龄鲫鱼（10.4±1.2 cm）和雅鱼，卵巢细胞增殖潜能通过PCNA蛋白免疫荧光染色验证。

研究结果

冷冻方案优化
在鲫鱼中建立的优化方案使冻融7天后的卵巢细胞（包括体细胞和卵原细胞）膜完整性达51.67±0.78%。该方案跨物种验证显示，雅鱼和斑马鱼分别达到65.12%和44.56%的膜完整性，且冻融组织仍具备体外培养潜力。

氧化应激与TP干预
冷冻显著提升雅鱼卵巢中MDA含量及SOD、CAT酶活性，证实氧化损伤机制。添加TP后，细胞膜完整性提升至73.82±4.89%，PCNA表达分析显示冻存细胞保持增殖能力，为后续生殖细胞移植（OTCTP）奠定基础。

讨论与意义
该研究首次系统解决了鲤科鱼类OTC中细胞大小异质性导致的冷冻效率差异问题，突破性地将抗氧化剂应用从哺乳动物拓展至鱼类。茶多酚通过清除自由基（ROS）和抑制脂质过氧化链式反应，保护了细胞膜结构和功能蛋白（如PCNA）。这一技术不仅为濒危鱼类如雅鱼的种质库建设提供支持，也为鱼类基因编辑、体外配子成熟等生物技术提供了细胞材料来源。未来研究可进一步探索冷冻对表观遗传（如DNA甲基化）的影响，以及TP在其他水生生物OTC中的普适性。