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针对 FAK 激酶抑制剂临床响应不足、无法同时抑制激酶依赖与非依赖功能及 PYK2 代偿问题，研究人员开展 LD2-LD4 肽靶向 FAK/PYK2 FAT 结构域疏水口袋的研究，发现其可显著抑制肿瘤生长与转移，为开发新型抑制剂提供策略。
在肿瘤研究领域，焦点黏着激酶（FAK）作为一种非受体酪氨酸激酶和衔接蛋白，常在癌症中过度表达，通过激酶依赖和非依赖的支架功能调控多种致瘤通路，是多种癌症的潜在治疗靶点。然而，目前进入临床试验的 FAK 激酶抑制剂因耐药性及无法同时靶向两种功能，未能产生客观临床响应，且其密切相关的旁系同源蛋白 PYK2 会补偿 FAK 的缺失，进一步影响治疗效果。因此，开发能同时抑制 FAK 和 PYK2 两种蛋白的激酶依赖与非依赖功能的新策略至关重要。
为解决上述问题，塞浦路斯大学（University of Cyprus）的研究人员开展了相关研究，旨在探索一种能有效抑制 FAK 和 PYK2 功能的新方法，以抑制肿瘤生长和转移。研究发现，表达针对 FAT 结构域疏水口袋（HP）的 LD2-LD4 肽可将 FAK 和 PYK2 从焦点黏着（FA）中置换出来，显著抑制肿瘤生长并几乎消除转移灶的出现。该研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》上，为癌症治疗提供了新的思路和策略。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过免疫共沉淀实验、蛋白质免疫印迹（Western Blot）分析和定量免疫荧光检测 LD2-LD4 表达对 FAK 和 PYK2 的影响；利用 2D 迁移、3D 侵袭和增殖实验进行肿瘤细胞迁移和增殖的体外研究；使用原位异种移植（xenograft）模型进行临床前实验，并进行免疫组织化学分析。
LD2-LD4 直接相互作用并有效从 FA 中置换 FAK 和 PYK2
在 FAK 敲除成纤维细胞中，LD2-LD4 肽与 PYK2 直接相互作用，有效将 PYK2 从 FA 复合体中置换出来，并显著降低 PYK2 Y402 位点的磷酸化水平，抑制其激酶活性。在同时表达 FAK 和 PYK2 的 U-118 MG 人胶质母细胞瘤细胞中，LD2-LD4 表达可有效将内源性 FAK 和 PYK2 从 FA 中置换出来，并减少 FAK Y397 和 PYK2 Y402 位点的磷酸化，同时抑制两者的激酶活性。
LD2-LD4 抑制 FAK 和 PYK2 并减少 MDA231-LM2-4175 乳腺癌细胞的增殖
由于 MDA-MB-231 细胞对强力霉素敏感，研究人员选用其高转移性衍生细胞系 LM2 细胞。LD2-LD4 表达可显著抑制 LM2 细胞增殖，导致细胞形态发生显著变化。免疫荧光和活细胞成像显示，LD2-LD4 诱导可有效将 FAK 和 PYK2 从 FA 中置换出来，且不影响其他核心 FA 蛋白的定位，同时降低 FAK、PYK2 及其下游靶点的磷酸化水平。
LD2-LD4 表达抑制肿瘤细胞的体外迁移和侵袭
活细胞延时分析和划痕实验表明，LD2-LD4 表达显著抑制 LM2 细胞的迁移能力。改良的胶原侵袭实验和球体实验显示，LD2-LD4 诱导可使 LM2 细胞的侵袭能力约降低六倍，表明其对肿瘤细胞的体外侵袭具有显著抑制作用。
LD2-LD4 表达对体内肿瘤进展和转移有显著影响
在原位异种移植小鼠模型中，LD2-LD4 表达可抑制肿瘤生长，且诱导时间越早，肿瘤生长速率越慢。同时，LD2-LD4 表达几乎消除了转移灶的出现，诱导时间越早，对肺转移的抑制作用越强。免疫组织化学分析显示，LD2-LD4 表达的肿瘤细胞若不关闭其表达则无法转移，进一步证明了其抗转移作用。
单个 LD 基序可从焦点黏着中置换 FAK 和 PYK2
研究发现，单个具有高亲和力的 LD 基序（如 Linker (3–4)-LD4）可有效置换 FAK 和 PYK2 从 FA 中，并抑制其活性，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。这表明具有高亲和力的小分子可能模拟 LD 基序的活性，为开发新型抑制剂提供了可能。
结论与讨论
本研究提出的从焦点黏着中置换 FAK 和 PYK2 的新策略，可独特地阻断两者的酶和支架功能，显著抑制转移，为开发更有效的小分子双 FAK/PYK2 抑制剂提供了可能。该策略克服了现有 ATP 竞争性抑制剂的局限性，为癌症治疗提供了一种极具潜力的新方法。未来，进一步探索模拟 LD 基序的拟肽化合物，有望推动该策略向临床应用迈进，为癌症治疗带来新的希望。
