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传统培养法研究树木种子真菌群落存在效率低、多样性揭示有限的问题。本研究利用 Illumina 短读长和 Oxford Nanopore（ONT）长读长宏条形码技术，结合传统培养法，分析 11 种树木种子真菌。发现两种测序技术捕获相似宿主依赖模式，短读长更适多样性研究，长读长在病原检测有潜力，为植物健康研究提供新工具。
树木种子作为植物生命周期的关键载体，其携带的真菌群落（种子微生物组）对种子萌发、幼苗健康及生态系统功能至关重要。然而，传统依赖培养的真菌研究方法存在耗时费力、无法捕获不可培养微生物（如专性寄生菌）以及低估群落多样性等局限。随着高通量测序技术的发展，基于 DNA 条形码的宏条形码技术（metabarcoding）成为揭示微生物群落多样性的有力工具，但不同测序平台在读取长度、测序深度和物种鉴定准确性上的差异，可能导致对真菌群落的评估偏差。因此，系统比较不同技术对种子真菌群落的检测能力，对于优化研究方法、准确解析微生物组功能具有重要科学意义。
瑞士联邦森林、雪和景观研究所（WSL）的研究人员 Jana Mittelstrass 团队开展了相关研究，旨在比较 Illumina 短读长测序（靶向 ITS2 区域）、Oxford Nanopore（ONT）长读长测序（靶向全长 ITS 区域）与传统培养法在解析 11 种被子植物和裸子植物种子真菌群落中的差异，探究不同方法对真菌分类单元、生活史策略（如病原体、腐生菌、内生菌）的捕获能力，以及宿主植物类型（被子植物 vs. 裸子植物）对群落结构的影响。研究成果发表在《Environmental Microbiome》。
研究主要采用以下技术方法：
- 样本采集与处理：分析来自三大洲的 58 份商业种子批次，包括 5 种被子植物和 6 种裸子植物，每批次取 100 粒种子进行表面消毒，一半用于培养，另一半提取 DNA 用于测序。
- Illumina MiSeq 测序：使用两组引物（Taylor 和 Tedersoo）扩增 ITS2 区域，进行高通量测序，数据分析包括 OTU 聚类（98% 相似度）和分类注释（UNITE 数据库）。
- ONT MinION 测序：扩增包含全长 ITS 的 rRNA 基因片段，利用纳米孔技术测序，提取 ITS 区域后进行 OTU 分析，因长读长误差率较高，分析时保留单例序列。
- 传统培养法：将种子半块接种于水琼脂培养基，分离真菌培养物，通过 Sanger 测序 ITS 区域进行鉴定。
- 数据整合与统计分析：比较不同方法的真菌属、种丰富度，分析 α 多样性（OTU 和属丰富度、香农指数）和 β 多样性（主成分分析、层次聚类），并基于 FungalTraits 数据库进行生活史分类。
研究结果
1. 不同方法揭示的真菌多样性差异
- Illumina 测序：Taylor 和 Tedersoo 数据集分别获得 244 和 217 个真菌属，约 82%-84% 的 OTU 可注释到属水平，39%-42% 可注释到种水平。被子植物种子的真菌属丰富度显著高于裸子植物（P<0.001），且优势属如链格孢属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）在两类植物中分布存在差异。
- ONT 测序：获得 226 个真菌属，属丰富度低于 Illumina，但 OTU 总数更高（14,094 个），主要因长读长技术捕获更多稀有类群。然而，高误差率（约 7.5%）导致单例 OTU 占比高，物种注释率（33%）略低于 Illumina。
- 传统培养法：仅鉴定 62 个真菌属，主要为可培养的腐生菌和常见病原菌（如镰刀菌属 Fusarium），但能获取纯培养物，与 Illumina 数据重叠率超 80%，表明培养法可捕获优势类群，但遗漏大量稀有和不可培养真菌。
2. 宿主依赖性群落结构
- α 多样性：被子植物种子的真菌属丰富度在 Illumina 数据中约为裸子植物的 2-3 倍，ONT 数据中差异稍小，但趋势一致。香农指数显示被子植物群落均匀度更高，裸子植物群落更集中于少数优势属。
- β 多样性：主成分分析（PCA）显示，Illumina 数据中真菌群落结构显著受宿主物种影响，如北美栎树（Quercus garryana）和日本红枫（Acer palmatum）种子真菌群落形成独立聚类；ONT 数据中宿主信号较弱，但仍可区分被子植物与裸子植物群落。PERMANOVA 分析表明，宿主组（6%）和物种（33%）是群落变异的主要驱动因素。
3. 真菌生活史策略分布
- 约 39%-46% 的 OTU 可归类为植物病原体、腐生菌或内生菌，其中病原体占比最高（如炭疽菌属 Colletotrichum、葡萄座腔菌属 Botryosphaeria），内生菌相对较少（如小丛壳属 Gnomoniopsis）。
- 被子植物种子中内生菌和腐生菌丰富度更高，裸子植物中病原体（如 Diplodia）相对富集，表明宿主植物类型可能影响真菌功能类群的组装。
结论与讨论
本研究表明，Illumina 短读长测序因高测序深度和成熟的分析流程，更适合真菌多样性的全面评估，尤其在检测稀有类群和宿主特异性群落结构方面优势显著；ONT 长读长测序虽因误差率和成本限制，目前在多样性覆盖上稍逊，但其全长 ITS 测序提升了物种鉴定准确性（如 Fusarium 在 ONT 数据中成为优势属），在病原检测和系统发育分析中具有潜力。传统培养法虽通量低，但能提供可用于功能研究的活菌株，与分子方法形成互补。
研究还发现，被子植物与裸子植物种子真菌群落在多样性和功能组成上存在显著差异，可能与种子结构、传播方式及宿主 - 微生物共进化历史相关。例如，被子植物复杂的种子形态和多样的传播媒介可能促进了更丰富的真菌定殖，而裸子植物（如松属 Pinus）的保护性鳞片结构可能筛选出特定病原体。
该研究为树木种子微生物组研究提供了方法学参考，强调多技术联用可更全面解析真菌群落。未来随着 ONT 技术误差率降低和参考数据库完善，长读长测序有望在真菌诊断和功能研究中发挥更大作用，而培养法仍是连接微生物分类与功能研究的关键环节。这些发现对森林健康监测、种子贸易检疫及植物 - 微生物互作机制研究具有重要意义。
