T7 RNA 聚合酶热稳定性的贪婪累积定向进化及其高温转录性能提升研究

T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）催化的体外转录（IVT）是治疗性 mRNA 大规模生产的金标准，但该酶催化会伴随产生双链 RNA（dsRNA）等有害杂质。研究人员通过 PROSS 服务器预测热稳定突变位点，经单点评估及多位点组合突变的贪婪累积优化，获得热稳定变体 M10（Tm：49.5°C），其在高温下催化活性强且 dsRNA 副产物显著减少，为高质量 mRNA 生产及下游纯化优化提供可能。

　　

T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）催化的体外转录（IVT）是治疗性 mRNA 分子大规模生产的金标准工艺。然而，T7 RNAP 的非预期催化活性会同时产生双链 RNA（dsRNA）等有害杂质，这不仅会加重下游纯化负担，还会引发安全隐患。本研究旨在通过改造 T7 RNAP 的热稳定性以实现高温 IVT，从而减少 dsRNA 生成。研究利用 PROSS 网络服务器，从 T7 RNAP 的中间体结构和延伸结构中预测热稳定突变位点。通过对单个突变位点的系统评估，再结合多位点组合突变体的贪婪累积优化，成功克服了进化过程中固有的活性 - 稳定性权衡问题，获得了热稳定变体 M10（熔解温度 T_m：49.5°C）。该变体在高温下表现出强劲的催化活性，同时显著减少了 dsRNA 副产物的形成。通过同源建模和分子动力学（MD）模拟进行的结构分析表明，累积的突变增加了 T7 RNAP 的局部刚性，使其构象更加紧凑，增强了螺旋倾向，并促使新盐桥的形成。这种优化的突变体有望作为高温 IVT 的有效生物催化剂，助力高质量 mRNA 的生产，这对于优化下游纯化流程和提高此类治疗药物的临床可行性至关重要。