重组腺相关病毒纯化新策略：氯化铯密度梯度超速离心技术优化与机制解析

本研究针对重组腺相关病毒(rAAV)生产中空壳颗粒(EPs)与完整颗粒(FPs)分离难题，系统探究了氯化铯密度梯度超速离心(CsCl-DGUC)技术的分离机制。通过理论模拟与密度梯度平衡分析超速离心(DGE-AUC)实验，首次阐明病毒蛋白(VP1/VP2/VP3)化学计量异质性及基因组长度对浮力密度的影响规律，开发出垂直转子快速纯化工艺。该研究为临床级rAAV生产提供了高效安全的纯化方案，发表于《European Biophysics Journal》。

　　

基因治疗领域近年来取得突破性进展，其中重组腺相关病毒(rAAV)因其安全性高、长期表达等特点成为最受欢迎的基因递送载体。然而在生产过程中，约半数病毒颗粒为空壳结构(EPs)，这些"无效载体"不仅降低治疗效果，还可能引发免疫反应。传统纯化技术难以区分完整基因组颗粒(FPs)与EPs，而氯化铯密度梯度超速离心(CsCl-DGUC)虽能基于浮力密度差异实现分离，但其分离机制不明、耗时过长等问题制约着临床应用。

大阪大学等机构的研究团队通过多学科交叉研究，首次揭示了rAAV颗粒在CsCl梯度中的分离本质。研究发现，病毒衣壳蛋白VP1/VP2/VP3的不同化学计量比会导致浮力密度差异，而基因组的存在会放大这种差异——2.5kb基因组使密度差异扩大1.8倍，4.7kb基因组更扩大至3.2倍。这解释了为何完整颗粒(FPs)会形成多个条带，而空壳颗粒(EPs)仅显示单一峰。研究还创新性地采用垂直转子替代传统摆桶转子，将超速离心时间从756小时缩短至24小时，通量提升12倍，为大规模生产扫清技术障碍。

关键技术包括：1)建立188种不同VP化学计量比衣壳的理论计算模型；2)密度梯度平衡分析超速离心(DGE-AUC)验证颗粒异质性；3)垂直转子(CsCl-DGUC)工艺优化；4)电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测CsCl残留；5)流式细胞术评估转导效率。

【分离FPs和EPs在CsCl密度梯度中的差异】通过理论计算发现，空壳颗粒(AAV8-EP)的偏比容(vbar_aq)变异系数仅0.03%，而携带2.5kb基因组的AAV8-CMV-EGFP达0.05%，4.7kb基因组的AAV8-FP更达0.09%。DGE-AUC实验证实，完整颗粒在2.90M CsCl中会形成FP1(低密度)和FP2(高密度)两个群体，其A₂₆₀/A₂₈₀比值相同，排除DNA异质性干扰。

【垂直转子CsCl-DGUC优化】相比摆桶转子需756小时达到平衡，垂直转子(VTi 50.1)仅需24小时即可形成理想梯度。在50,000rpm条件下，成功分离AAV2-CMV-EGFP与AAV2-EP，沉降速度分析(SV-AUC)显示分离纯度>99%。单次运行可处理468mL样本，满足工业化需求。

【CsCl对转导效率的影响】ICP-MS检测显示透析后CsCl残留<10ppb。体外实验证实，≤1mM CsCl不影响HeLaRC32细胞活力，3M CsCl浸泡7天的rAAV经透析后，其转导效率与对照无显著差异(P>0.05)。

这项研究从理论到实践系统解析了CsCl-DGUC技术的分离机制，建立了快速高效的rAAV纯化新方案。特别值得注意的是，研究发现不同VP化学计量比的衣壳具有不同生物活性，这为定向富集高活性rAAV颗粒提供了新思路。垂直转子的成功应用解决了传统方法耗时长的痛点，使CsCl-DGUC技术重新成为临床级rAAV生产的优选方案。该成果不仅推动基因治疗载体生产工艺革新，其揭示的"基因组放大密度差异"机制更为其他病毒载体纯化提供了重要参考。