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为解决创新霉素（CM）及去甲基创新霉素（NCM）产量低、活性类似物有限的问题，研究人员通过异源表达、启动子优化等策略开展高产研究，获 11 种卤代衍生物，其中 5-F-CM 和 7-F-NCM 活性显著，为抗结核药物开发奠定基础。
结核病（TB）作为由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引发的全球性传染病，其危害不容小觑。据世界卫生组织数据，全球约四分之一人口感染结核分枝杆菌，2023 年结核病再度成为单一感染源致死首位，每年导致约 125 万人死亡，且耐多药结核病（MDR-TB）更是公共卫生危机。开发具有新靶点和作用机制的抗生素迫在眉睫。创新霉素（Chuangxinmycin, CM）是上世纪 70 年代从济南游动放线菌（Actinoplanes tsinanensis CPCC 200056）中发现的吲哚生物碱抗生素，具有独特的二氢硫代吡喃 [4,3,2-cd] 吲哚骨架，对结核分枝杆菌 H37Rv 及耐药临床分离株展现出强效活性，其同源物去甲基创新霉素（norchuangxinmycin, NCM）虽对多数细菌抗菌活性减弱，但仍保留抗结核活性，暗示存在除抑制色氨酰 - tRNA 合成酶（TrpRS）外的新机制。然而，CM 和 NCM 产量低、活性类似物匮乏，严重制约了其作为抗结核药物的开发进程。
为突破这些瓶颈，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所等机构的研究人员开展了相关研究。他们利用合成生物学技术，通过多策略协同优化，实现了 CM 和 NCM 的定向高产，并成功制备卤代衍生物，为抗结核药物研发提供了重要物质基础。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》。
研究中采用的主要关键技术方法包括：一是异源表达技术，将 CM 和 NCM 的生物合成基因克隆至表达载体，导入链霉菌属宿主（如天蓝色链霉菌 M1452 等）进行表达；二是启动子优化，在原始产菌株中通过不同启动子（如 isa2027p 等）驱动簇定位调控因子 cxnR 过表达，提升 CM 产量和比例；三是发酵培养基筛选，对 ISP2、鱼粉培养基等 4 种培养基进行筛选，优化碳氮源组成以提高产量；四是前体导向生物合成，向发酵体系中添加卤代色氨酸（如 5/6/7-F/Cl-Trp 等），通过生物合成途径引入卤素原子，生成卤代衍生物。
靶向高产 CM 和 NCM
研究首先针对原始菌株 CM 产量低（平均 15.0 mg/L）、NCM 含量少（平均 8.6 mg/L）且含杂质的问题，采用异源表达策略。将 CM 和 NCM 的生物合成基因分别克隆至质粒 pL-CxnA?-F 和 pL-CxnB-F，转入链霉菌宿主。结果显示，天蓝色链霉菌 M1452/pL-CxnB-F 产 NCM 最高达 32.0 mg/L，是原始菌株的 3.7 倍；添加维生素 B??优化甲基化效率后，M1452/pL-CxnA?-F 的 CM 比例从 30% 提升至 62%，产量达 84.6 mg/L。进一步在原始菌株中过表达簇定位正调控因子 cxnR，选用 isa2027p 启动子时 CM 产量较 ermE*p 提高 1.4 倍。通过培养基筛选，在玉米浆培养基（M3）中 NCM 产量达 117.6 mg/L（13.7 倍提升），在鱼粉培养基（M2）中 CM 产量最高达 192.4 mg/L，放大至 42 L 发酵罐后 CM 产量达 301 mg/L（20.1 倍提升），创实验室最高纪录。
卤代衍生物的生物合成与活性评价
研究通过前体导向生物合成策略，向发酵体系中添加多种卤代色氨酸，成功获得 11 种卤代 CM 衍生物，其中 6 种（5-F-CM、5-F-NCM、7-F-NCM 等）经 HR-MS、NMR 等确证结构。活性测试表明，5-F-CM 和 7-F-NCM 对结核分枝杆菌 H37Rv 及异烟肼 / 利福平耐药临床分离株的最低抑菌浓度（MIC）分别为 4 μg/mL 和 4 μg/mL，与 CM 相当，而氯代衍生物活性较弱，可能因氯原子空间位阻影响与 TrpRS 结合。分子对接显示，氟代衍生物与 TrpRS 结合模式与 CM 相似，支持其作用机制。此外，CM 及其衍生物对人肝癌细胞（Huh7 等）的细胞毒性（CC??）≥64 μg/mL，安全性较好。
研究结论表明，通过异源表达、启动子优化、培养基筛选等多策略协同，实现了 CM 和 NCM 的定向高产，其中 CM 产量达 301 mg/L，NCM 达 117.6 mg/L，均为目前实验室最高水平。首次通过生物合成而非化学合成获得 CM 卤代衍生物，尤其是卤代 NCM 衍生物，拓展了结构多样性。氟代衍生物 5-F-CM 和 7-F-NCM 展现强效抗结核活性，为深入研究 CM 抗结核机制及开发新型抗结核药物提供了丰富的物质基础和新方向。该研究凸显了合成生物学在天然产物定向改造和高产中的优势，为解决抗生素开发中产量和结构多样性难题提供了范例，有望加速 CM 类抗结核药物的临床前研究进程。
