编辑推荐：
【编辑推荐】为解决异源小分子（SM）合成中酶折叠效率低的问题，研究人员构建含 68 株过表达内源性胞质分子伴侣的酿酒酵母菌株库，结合交配筛选法，以曲霉属 aspulvinone E 为模型，发现 YDJ1 与 SSA1 共表达可使产量提升 84%，为细胞工厂优化提供新工具。
在微生物合成领域，异源小分子（SM）的生产常受限于宿主细胞内酶蛋白的折叠效率。尤其是涉及多结构域合成酶（如非核糖体肽合成酶 NRPS、聚酮合成酶 PKS）的代谢通路，单个酶的折叠缺陷即可导致整体产量低下。尽管分子伴侣在提升异源蛋白折叠中已广泛应用，但在小分子合成中的研究却极为有限。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为重要的细胞工厂，其分子伴侣系统能否优化异源小分子合成路径，成为亟待探索的科学问题。
丹麦技术大学（Technical University of Denmark）的研究团队针对这一挑战，开展了系统性研究。他们构建了包含 68 株过表达内源性胞质分子伴侣（涵盖 HSP40、HSP70、HSP90 等家族）的酿酒酵母菌株库，并开发了基于交配的筛选方法，将分子伴侣库与携带目标小分子合成路径的菌株结合，以快速鉴定增效伴侣组合。该研究以曲霉属真菌来源的 aspulvinone E 为模型化合物，其合成依赖 MelA 合成酶（一种 NRPS 样酶）和 NpgA 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。通过荧光信号定量检测 aspulvinone E 产量，研究团队成功筛选到关键分子伴侣组合，并验证了其在液体发酵中的增效作用。相关成果发表于《Microbial Cell Factories》。
研究采用的核心技术包括：
- 分子伴侣过表达菌株库构建：在 CEN.PK113-5D 菌株背景下，利用 TEF1 启动子驱动 68 种单 / 双分子伴侣基因（如 YDJ1、SSA1、HSC82 等）在 X-2 和 X-4 基因组位点整合表达。
- 交配筛选系统：通过 MATa 型分子伴侣库与 MATα 型 aspulvinone E 合成菌株（含 melA 和 npgA 基因）交配，在 SC-Ura + Gal + G418 培养基筛选二倍体，利用 UV 荧光成像定量分析产量。
- 代谢工程验证：通过摇瓶发酵和 UHPLC-DAD-TOFMS 检测，验证筛选到的伴侣组合对 aspulvinone E 产量的提升效果，并通过 MelA-mRFP 融合蛋白荧光强度表征酶表达水平。
关键研究结果
1. 交配筛选法鉴定增效分子伴侣
通过两轮独立筛选（每组合 16 个克隆），发现 YDJ1 单过表达及 SSA1+YDJ1 共表达显著提升 aspulvinone E 荧光信号（p<0.01）。其中 SSA1+YDJ1 组合在固体培养基中荧光强度最高，且在液体发酵中使产量提升 84%，显著优于其他单 / 双伴侣组合。
2. 分子伴侣对酶表达的影响
构建 MelA-mRFP 融合蛋白表达菌株后发现，SSA1+YDJ1 共表达菌株的 mRFP 信号在 48 小时后显著高于对照（p<0.05），表明伴侣组合通过促进 MelA 合成酶折叠或稳定化，增加其胞内丰度，进而提升 aspulvinone E 产量。该效应在 SD-urea 培养基中通过 UHPLC 检测得到验证，共表达菌株的 aspulvinone E 峰值面积较对照增加 20%。
3. 筛选方法的普适性与局限性
研究发现，尽管 aspulvinone E 合成路径仅涉及两个异源酶，但其产量仍受分子伴侣调控，暗示更复杂的小分子合成路径（如多酶级联反应）可能更依赖伴侣辅助。此外，筛选中观察到的组合效应（如 SSA1 与 YDJ1 的协同作用）难以通过单基因过表达预测，突显了系统性筛选的必要性。研究同时指出，二倍体筛选可能因基因剂量稀释低估伴侣效应，未来可结合单倍体合成遗传阵列（SGA）技术优化。
结论与意义
该研究首次建立了酿酒酵母胞质分子伴侣过表达文库及基于交配的高通量筛选平台，证明分子伴侣组合（如 SSA1+HSP40 家族的 YDJ1）可通过增强异源酶折叠效率提升小分子产量。这一方法为代谢工程提供了新工具，尤其适用于依赖复杂多结构域酶的天然产物合成，如萜类、聚酮类化合物。此外，研究提出的 “通过荧光标记关键酶筛选伴侣” 策略，为无直观表型的小分子合成优化提供了新思路。未来可扩展至跨物种伴侣基因（如植物来源分子伴侣）及转运蛋白基因的共表达筛选，进一步提升细胞工厂的合成效率。
研究揭示了分子伴侣网络在异源代谢路径优化中的关键作用，为微生物细胞工厂的理性设计提供了重要理论依据和技术支撑，有望加速天然产物的工业化生产进程。
