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该综述聚焦工程化细胞在精准药物递送中的应用，开发双响应合成基因回路（含 NF-κB 和 E’box 元件）。其可通过 OR 门逻辑响应炎症和昼夜节律信号，动态调控 IL-1Ra 等药物输出，为类风湿关节炎等炎症性疾病的治疗提供新策略。
研究背景与目标
在复杂疾病中，内源性病理信号如炎症会在不同时间尺度动态变化。以类风湿关节炎（RA）和青少年特发性关节炎（JIA）为例，局部和全身炎症信号每日波动，清晨达峰值，还可能长期持续引发长达数周数月的发作。然而，改善病情的抗风湿药物（DMARDs）通常以持续高剂量给药，未考虑疾病活动和炎症信号水平。此前研究开发了基于时间遗传回路（时钟基因响应元件）和炎症响应回路（NF-κB 敏感元件）的细胞给药系统，分别应对不同时间尺度的发作。本研究旨在开发一种新型双响应合成基因回路，通过 OR 门逻辑同时响应昼夜节律和炎症输入，实现每日定时治疗输出及慢性炎症条件下增强治疗输出。
材料与方法
基因回路设计
设计了炎症响应（NFκB-LUC、NFκB-IL1Ra）和昼夜节律响应（E’box-GFP-LUC、E’box-IL1Ra）回路。NF-κB 驱动回路包含五个典型 NF-κB 识别基序、上游负调控元件和下游最小 CMV；E’box 驱动回路由三个串联 E’box 和最小 CMV 组成。通过 PCR 扩增从 NFκB-LUC 分离五个 NF-κB 识别基序，添加同源臂后，利用 Gibson 组装将其插入 E’box-GFP-LUC 或 E’box-IL1Ra 的三个串联 E’box 上游，构建 NFκB.E’box 启动子的双响应回路，经 Sanger 测序确认正确插入。
诱导多能干细胞（iPSC）衍生软骨分化与培养
iPSCs 在经丝裂霉素 C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养 5 天，去除 MEFs 后，以高密度微团培养 14 天进行软骨分化，期间在第 3 天和第 5 天添加骨形态发生蛋白 4（BMP-4）和地塞米松。微团经蛋白酶和胶原酶 II 消化后，作为预分化 iPSCs（PDiPSCs）在含碱性成纤维细胞生长因子的培养基中扩增，收集后制成软骨 pellet，在含地塞米松、抗坏血酸、脯氨酸和转化生长因子 -β3（TGF-β3）的软骨形成培养基中维持 21 天。测试前，细胞用地塞米松同步化 1 小时，再在不含地塞米松和生长因子的培养基中培养，同步化后通过添加 IL-1β 诱导炎症挑战。
慢病毒生产与细胞转导
采用标准方案生产第二代包装的水疱性口炎病毒糖蛋白假型慢病毒，HEK293T 细胞通过磷酸钙沉淀法转染 psPAX2 包装载体、pMD2.G 包膜蛋白载体和表达载体，收集、过滤培养基并储存于 - 80°C。在 HeLa 细胞中进行病毒滴度测定以确定感染复数（MOI），软骨细胞在 PDiPSC 阶段以约 3 的 MOI 和 4 μg/mL 聚凝胺进行转导 24 小时。
生物发光回路表征
在避光的 CO?控制培养箱中，以 15 分钟间隔记录生物发光作为相对发光单位（RLU）。同步化后，细胞在含酚 - free 培养基和优化的 100 μM 萤火虫 D - 荧光素钾盐中培养用于记录。炎症挑战期间，更换含荧光素和不同浓度 IL-1β 的新鲜培养基。对于 pellet 记录，丢弃换液后前 2 小时数据，考虑前 12 小时内添加新鲜培养基引起的发光初始增加，将挑战样本与接受相同换液条件的未挑战对照进行比较，监测单层细胞至少两个周期、三维 pellet 三个周期的昼夜信号。使用 Prism GraphPad 量化曲线下面积（AUC），确定挑战后相对峰值，以各组未挑战对照进行归一化。对于昼夜信号，用 Prism GraphPad 拟合正弦曲线（非零基线正弦波非线性拟合，最小二乘回归，约束波长 < 18），确定至少 48 小时内的周期和基线，仅对未挑战的 NFκB.E’box 驱动样本进行分析。通过量化顺序转导 NF-κB 和 E’box 驱动回路的细胞与单独转导任一回路细胞的平均发光差异，评估相对输出动态。
基因表达
样本在 - 80°C 保存直至 RNA 分离，pellet 用微型珠磨机匀浆，按试剂盒（Norgen Biotek）分离 RNA，用 Invitrogen SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒制备互补 DNA（cDNA），通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测基因表达，采用 ΔΔCT 法确定相对于内源性 Gapdh 的相对表达倍数变化，引物由 Integrated DNA Technologies 合成并验证效率。随时间推移的 Il1rn 输出通过平均表达的 AUC 量化，以标准误差报告总面积。
酶联免疫吸附测定
收集培养基并储存于 - 20°C 直至分析，使用 R&D Systems DuoSet 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，在 450 nm 和 540 nm 处读取吸光度，一式两份定量培养基中 IL-1Ra 浓度，随时间推移的 IL-1Ra 浓度输出通过平均表达的 AUC 量化，以标准误差报告总面积。
pellets 生化分析
样本收集后储存于 - 20°C 直至消化，pellet 在 65°C 用木瓜蛋白酶消化过夜，用 1,9 - 二甲基亚甲蓝（DMMB）测定总硫酸化糖胺聚糖（GAG）含量，按制造商协议用 PicoGreen 测定（Thermo Fisher）定量总 DNA 含量，进行归一化。
pellets 组织学分析
制备组织学样本时，pellet 用福尔马林溶液固定，乙醇脱水，石蜡包埋，制成 8-μm 厚切片，用番红 - O、固绿和苏木精染色，使用 Olympus VS120 显微镜在 20 倍放大下拍摄明场图像。
统计分析
生物发光信号的量化指标（AUC、基线、周期）通过单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 多重比较检验或 t 检验进行评估。时程数据（Il1rn、IL-1Ra）通过双因素方差分析和 Sidak 时间点多重比较检验进行评估。挑战后 24 或 72 小时的蛋白质积累、蛋白聚糖含量和基因表达通过单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验进行评估。
结果
双 NF-κB 和 E’box 响应启动子在炎症挑战期间产生基础水平昼夜输出和按需增强输出
在体外单层 PDiPSCs 中，生物发光报告系统表征基因回路在模拟关节炎发作的炎症挑战存在或不存在时的动态表达动力学。NF-κB 驱动系统按需响应炎症挑战，而 E’box 驱动系统由于昼夜调节自主开启和关闭。NF-κB 驱动输出（NFκB-LUC）随挑战增加，相对 AUC 与 IL-1β 浓度成比例，无昼夜表达趋势。E’box 驱动的时间遗传输出（E’box-GFP-LUC）被 IL-1β 挑战抑制，表现为 AUC 和正弦曲线拟合基线降低，周期长度增加，但通过监测多个周期的循环幅度动态变化确认昼夜输出。
构建的双响应回路（NFκB.E’box-GFP-LUC）在无炎症挑战时表现出基础水平昼夜输出，具有 24 小时周期，由于对炎症挑战的响应，AUC 量化显示挑战后输出增强，其生物发光曲线与顺序转导 NFκB 和 E’box 驱动回路的细胞密切一致，表明累加响应。值得注意的是，双响应设计测量的昼夜成分平均原始发光低于单独的 E’box-GFP-LUC，可能是由于引入 NF-κB 响应元件后转录元件在该启动子上的结合差异，但不影响昼夜表达模式或周期。因此，双响应 NF-κB 和 E’box 驱动启动子为 RA 发作期间的治疗递送提供了组合激活模式。
NFκB.E’box-IL1Ra 在 IL-1β 挑战下产生增强的治疗输出
在分化的软骨 pellet 中评估回路的潜在治疗效用，无论是否挑战，培养培养基中 IL-1Ra 浓度随时间增加，达到与昼夜 E’box 驱动回路相似的幅度。但挑战后 24 小时，挑战组的 Il1rn 表达和 IL-1Ra 产生显著高于未挑战组，表明由于 NF-κB 响应性增强激活，挑战期间相对 AUC 呈增加趋势，代表挑战后前 24 小时治疗表达或输出约增加 30%。
双响应治疗设计抑制炎症激活
确认回路响应炎症激活增强生物药物生产后，研究治疗回路影响软骨 pellet 炎症状态的能力。使用 NFκB.E’box-GFP-LUC 作为整体炎症的报告基因，比较仅转导报告基因或同时转导报告基因和治疗版本回路的 pellet 中炎症激活水平（AUC 量化）。挑战前，各组 AUC 无显著差异。用 1 ng/mL IL-1β 挑战后，有或无治疗回路的组中炎症激活显著增加，分别是各自未挑战对照的约 2 倍或 4 倍。尽管如此，与不含 NFκB.E’box-IL1Ra 的组相比，含治疗回路的组 AUC 响应显著降低，挑战后生物发光相对峰值也显著降低，接近基线水平，表明 NFκB.E’box-IL1Ra 抑制炎症激活的能力。
NFκB.E’box-IL1Ra 保护关节炎体外模型免受炎症降解
在关节炎体外模型中，双响应回路在挑战存在下的 IL-1Ra 输出显著高于其未挑战对照，强调其在炎症条件下增强治疗递送的能力。这与组织基质保护一致，通过硫酸化 GAG 含量定量显示近乎完全保护，通过红色番红 - O 染色的蛋白聚糖组织学染色定性显示维持。此外，与未转导对照相比，软骨基因表达的丧失和炎症基因表达的激活减少，表明双响应回路设计在模拟关节炎发作条件下提供组织水平保护。
讨论
本研究设计并测试了一种新型合成基因回路，响应昼夜节律和炎症信号通路，用于定时时间遗传和炎症反馈控制的基于细胞的药物递送。该基因回路成功展示了按需独立和双响应合成生物药物的能力。在无炎症挑战时，该回路通过 E’box 元件响应内源性昼夜转录反馈信号，在 24 小时周期内自主循环。在炎症挑战期间，该回路通过中央炎症通路调节输出增强，使其能够感知和响应动态环境。通过这种 OR 门数字逻辑，炎症或昼夜输入均可导致疾病相关激活，实现微调治疗释放。通过这种双重响应，该回路展示了一种概念验证设计，以解决 RA、JIA 或其他在每日和长期尺度上发生的炎症性疾病中发作的复杂性。
生理上，RA 患者滑液和血清中 IL-1β 浓度约为 0.1 ng/mL，尽管因患者而异，1 ng/mL IL-1β 已被证明影响昼夜节律。因此，在单层细胞中评估 0、0.1 或 1 ng/mL IL-1β 的回路活性剂量反应，并选择在 iPSC 衍生 pellet 中以最大剂量 1 ng/mL 评估结果，以确保在高于预期生理条件的水平下有效。如实时回路激活动力学的生物发光报告基因和离散时间点 IL-1Ra 的治疗释放曲线所示，NFκB.E’box 启动子在炎症挑战存在下的激活显著高于不存在时。虽然在特定时间点从培养基中测量的累积 IL-1Ra 不能显示输出的周期性变化，但已证明 E’box-IL1Ra 的 IL-1Ra 治疗生产变化率具有约 24 小时周期的周期性。在本研究开发的双响应回路中，与未挑战对照相比，IL-1β 挑战期间 IL-1Ra 输出增强，可更好地应对炎症性关节炎的短期和长期变化。
传统上，治疗药物在规定时间给药，如每日或每周，不考虑动态疾病状态，有效 functioning as open-loop systems，导致给药剂量与所需剂量不匹配，可能导致副作用，同时使疾病不受控制。在 RA 和 JIA 等自身免疫性疾病中，由于疾病严重程度和药物反应性随时间推移可能降低的不可预测发作，疾病管理极具挑战性。面对这些挑战，使用实时输入在最有益时提供治疗递送的闭环系统可能有助于改善疾病控制。由于细胞具有感知环境并快速响应的必要机制，将这些工具改编形成基因回路是自然稳态机制的相对直接延伸。此外，这与 IL-1Ra 等治疗药物的组成性递送形成对比，后者可能甚至恶化关节炎结局，而本设计通过量身定制的时间治疗和按需策略匹配疾病动态递送药物。
本研究的目标是生成一个系统，在各种自身免疫性疾病如 RA 和 JIA 的炎症特征的多个时间尺度上提供生物药物合成的动态控制。通过这种设计，基因回路可以用单个启动子 - 输出盒引入。虽然现有的基因回路迭代单独针对不同的环境线索，包括炎症、昼夜节律或机械激活，但双响应回路解决了两个相互关联的疾病相关条件，实现了更可调的控制。其他人已在哺乳动物细胞中成功开发了包括扩增、反馈控制和数字逻辑等工具的电路系统，用于精确治疗递送，这些元件支持更可控的递送，但通常需要正交组件，增加了系统复杂性。在此，开发的系统不需要引入非天然信号分子或转录机制进行电路转导，而是通过双响应启动子通过内源性信号通路激活，创建了一个简单但多方面的系统。
总之，这种双响应合成基因回路有潜力解决炎症性关节炎中合成基因回路控制的挑战。除了关节炎，其他炎症性疾病也涉及相关的炎症和昼夜变化，包括但不限于炎症性肠病和慢性气道疾病，这种概念验证电路设计可以定制以解决多种条件。在此，证明了 E’box 驱动的节律可用于双响应系统，但 24 小时周期中的其他阶段可以用如 D-boxes 或 RREs 等昼夜响应元件靶向，这些元件的组合可能能够在更精确的时间编码昼夜表达。同样，治疗输出可以根据所需治疗蛋白进行调节，如先前生成产生 IL-1Ra 或可溶性肿瘤坏死因子受体的回路的努力。由于该系统是在软骨模型中开发的，该设计可以转化为体内研究，因为软骨是无血管和无神经的，可以皮下植入用于长期治疗递送。此前已证明，编辑包含基因回路的生物工程软骨构建体可以作为感知和响应环境线索的活药物递送装置，使用这种转化策略，已在体内实现概念验证的炎症和昼夜驱动治疗递送。
结论
开发了一种双响应合成基因回路，用于递送抗炎生物药物，解决炎症信号的急性和长期变化。这是通过分别重新利用驱动炎症和昼夜基因表达的两个主要转录网络的元件来实现的。通过这种方法，双响应基因回路产生了动态和可调的输出，有可能在预期疾病活动的每日变化时递送药物，并响应持续发作以获得最佳结果。
