Nature Methods：超分辨率神经元电压成像技术突破组织散射极限

为解决组织散射限制密集神经元群体电压成像的问题，研究人员开展活动定位成像（ALI）技术研究。利用稀疏动作电位（APs）激活，精确定位荧光变化，实现超分辨率成像。结果显示其精度超散射限制十倍，为神经活动研究提供新工具。

　　

在神经科学领域，大脑中密集神经元群体的活动记录一直是极具挑战性的难题。神经元通过短暂的电信号 —— 动作电位（APs）进行计算和通信，这些仅持续约 1 毫秒的信号承载着感知、行为和思想的丰富信息。电压敏感荧光蛋白可将 APs 转化为荧光强度的快速变化，为测量神经元信号提供了手段，但在体内从密集神经元群体中提取这些信息面临重重困难。

成像密集神经元的电压信号需要高时空分辨率。双光子显微镜虽能提供出色的空间分辨率，但其速度受限，尤其在成像大群体神经元时力不从心；单光子成像方法虽能实现千赫兹速度和大视野，但组织散射使得难以分辨紧密相邻的神经元，限制了可同时研究的神经元数量和密度。散射不仅使神经元识别复杂化，还难以精确量化其反应，现有算法如 PCA、ICA、NMF 等需要神经元数量和 / 或位置的先验知识，在密集标记样本中常产生虚假或不纯成分，无法捕捉单个细胞的活动。

为突破这一困境，国立阳明交通大学神经科学研究所与脑研究中心的研究人员开展了相关研究，成果发表在《Nature Methods》。

研究主要采用的关键技术方法包括：利用自定义宽场显微镜以 2000 帧 / 秒的速度对表达荧光电压指示剂 Voltron2 的小鼠海马 CA1 锥体神经元进行体内电压成像；通过子宫内病毒注射将 Voltron2 表达限制在薄神经元层以减少离焦污染；运用基于奇异值分解（SVD）的去噪技术处理荧光变化图像；采用峰值检测算法对动作电位进行聚类分析；结合双光子显微镜对同一视野进行结构成像以验证 ALI 识别的神经元簇。

ALI 技术原理与验证

研究人员引入活动定位成像（ALI）技术，其原理类似于超分辨率成像中的定位显微镜。尽管密集标记的神经元荧光重叠，但在任何给定时间只有稀疏的神经元群发放 APs。ALI 通过精确定位每个 AP 事件相关的荧光变化，创建 AP 发生的高分辨率图。在小鼠海马神经元的实验中，通过检测 APs 作为高通滤波荧光电影中的峰值，获取每个 AP 峰值时间的荧光变化图（ΔF 图像），经 SVD 去噪后确定每个 AP 的中心位置，生成 AP 密度空间图（ALI 图像），可分辨四个不同的 AP 簇，且 AP 定位精度比光学信号的典型尺寸小得多（某些情况下超过十倍）。通过将 AP 聚类并平均 ΔF 图像得到神经元 “足迹”，尽管存在散射引起的串扰，ALI 仍能通过识别重叠神经元及其足迹，利用最小二乘回归提取发放和亚阈值活动，且串扰极低。

ALI 与现有算法在模拟数据中的对比

在模拟数据中，研究人员将 ALI 与 VolPy、SGPMD-NMF 等现有信号提取算法进行对比。模拟两个具有固定足迹大小和恒定 AP 数量的神经元，分离度 s 设为 1.25w、1.0w、0.75w、0.5w 和 0.25w 以模拟重叠增加的情况。当分离度 s≥w 时，所有算法均能成功识别两个模拟神经元；但当重叠超过散射极限（s<w）时，VolPy 和 SGPMD-NMF 无法检测到两个不同神经元，提取的轨迹混合了两个神经元的真实脉冲序列，而 ALI 利用 AP 的精确位置，即使在最小分离度下也能准确分辨两个神经元，忠实恢复两者的足迹并提取与真实脉冲序列高度匹配的活动轨迹。

ALI 在大神经元群体中的成像

研究人员在体内以 2000 帧 / 秒的速度同时成像超过 100 个密集标记的海马神经元，将图像分成小补丁进行处理，组装 AP 坐标生成 ALI 图像，将 AP 分离成 113 个不同簇，确定各簇的足迹和对应活动轨迹。尽管荧光重叠，ALI 仍能揭示附近神经元不同的脉冲序列，相邻感兴趣区域（ROI）的信号相关性高，而 ALI 报告的活动相关性低，且 ALI 报告的脉冲序列有明确的不应期，ROI 脉冲序列常出现不应期窗口内的脉冲间隔（ISI）违规事件，表明 ALI 能有效避免强污染。

ALI 与结构识别神经元的对应关系

通过双光子显微镜对电压成像后的同一视野进行成像，发现 ALI 识别的所有簇（113 个）均可映射到双光子 z 栈中识别的神经元，空间分布与双光子图像中的神经元位置精确匹配。部分双光子 z 栈中可见的神经元未出现在 ALI 图中，可能是记录期间未发放 AP 的 “沉默细胞” 或 AP 太弱、位置太近无法与相邻簇区分。

ALI 在体内与现有算法的对比

在相同体内数据集上，ALI 与 VolPy、SGPMD-NMF 对比，所有算法均能稳健识别分离良好的神经元，但在更拥挤的场景中，ALI 表现更优，能准确检测紧密相邻的神经元，而 VolPy 和 SGPMD-NMF 常将多个神经元合并为一个检测细胞。在 ALI 识别的 106 对相邻神经元（间距 < 35μm）中，仅 4.7% 和 18.9% 被 SGPMD-NMF 和 VolPy 区分为单独细胞，且 SGPMD-NMF 约 44% 的检测神经元存在活动污染。

ALI 在不同成像方式中的应用

ALI 还应用于先前发表的数据集，包括使用靶向照明的小鼠海马小白蛋白（PV）中间神经元和使用光片显微镜的斑马鱼脊髓神经元。在靶向照明显微镜中，ALI 揭示一些照明光斑实际包含多个神经元；在光片显微镜中，ALI 能识别光片图像中无法区分的神经元，提取其脉冲模式，显示出在不同实验条件下区分神经元活动的 versatility。

ALI 揭示密集 CA1 神经元的 θ 振荡相位锁定多样性

在清醒行为小鼠的海马 CA1 区，利用 ALI 以 2000 帧 / 秒同时记录数百个锥体神经元，直接从群体发放模式中观察到 θ 频率节律。单个神经元表现出不同的相位调制，包括相位锁定强度和偏好相位角的差异，且这种差异在紧密相邻的神经元中常见。对间距 < 35μm 的 40 对相邻神经元分析显示，尽管邻近，它们的相位锁定强度和偏好相位角不同，随机分配 AP 时相位调制差异显著减小，表明 ALI 通过利用每个 AP 的空间信息，揭示了紧密相邻神经元中 θ 相位锁定的多样性。

ALI 通过精确定位 AP，为解决散射组织中重叠神经元的分辨问题提供了简单有效的方法，确立了精确定位作为提高分辨率的通用策略。该技术在体内能分辨现有信号提取算法和人类观察者无法分辨的神经元，实现高密度、高速的神经元群体成像，直接观察群体脉冲序列中的振荡结构，区分密集局部网络中神经元的特定相位锁定。其优势在于通过 AP 精确定位实现高分辨率，而非依赖大量像素，可利用有限相机像素实现更大视野，减少数据量和计算成本。

尽管 ALI 目前应用于单光子电压成像，但其原理可能适用于双光子功能成像、钙成像、神经递质成像等其他神经元功能成像，以及空间重叠信号的场景。未来，随着指示剂亮度和灵敏度的提高、去噪算法的改进、光稳定性和记录持续时间的改善、算法优化和成像硬件升级，ALI 有望更接近实现密集神经元回路中电压动态的完整映射，为理解大脑功能和神经网络机制提供强大工具。