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为探究 SPARDA 系统防御机制，研究人员以 Novosphingopyxis baekryungensis NbaSPARDA 为对象，通过冷冻电镜（cryo-EM）揭示其经 guide RNA–target DNA 异源双链形成触发 filament 组装，激活核酸酶活性的机制，为细菌免疫及生物技术提供新方向。
细菌防御机制的新拼图：NbaSPARDA 系统激活机制的冷冻电镜解析
在微生物的生存竞赛中，细菌面临着噬菌体、质粒等遗传元件的持续威胁，发展出多样的防御系统。其中，基于 Argonaute 蛋白（Agos）的防御机制近年来备受关注。Agos 是一类在生命各域中保守的核酸引导蛋白，通过小核酸（如 RNA 或 DNA）识别互补靶标，介导免疫反应。在原核生物中，短原核 Argonaute（short pAgos）因其结构简约性和功能多样性成为研究热点。这类蛋白缺乏完整催化结构域，需与效应蛋白协同作用，通过 “自杀式防御” 等策略阻止入侵者扩散。然而，短 pAgos 如何通过分子组装激活效应功能，尤其是核酸酶活性的具体机制，长期以来仍不清晰。
为填补这一知识空白，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（上海生物化学与细胞生物学研究所）的研究团队聚焦于 Novosphingopyxis baekryungensis 的 NbaSPARDA 系统（属于短 pAgos 的 S2B 进化枝），开展了系统性研究。该团队的成果发表于《Cell Research》，首次通过冷冻电镜（cryo-EM）技术捕获了 NbaSPARDA 在不同功能状态下的超微结构，揭示了其从单体到 filament 组装的动态激活过程，为理解细菌防御的分子基础提供了关键线索。
研究技术方法
研究团队主要运用以下技术手段：
- 冷冻电镜（cryo-EM）：解析 NbaSPARDA 在空载（apo）、结合向导 RNA（gRNA）、结合靶 DNA（tDNA）等五种功能状态下的高分辨率结构，观察分子构象变化。
- 生化分析：通过荧光淬灭核酸底物检测 NbaSPARDA 的核酸酶活性，分析其对单链 DNA（ssDNA）、双链 DNA（dsDNA）、RNA-DNA 杂交链等底物的降解能力。
- 结构功能关联研究：通过突变分析验证关键结构域（如 APAZ、DREN）在组装和催化中的作用，结合序列比对探讨进化保守性。
研究结果解析
NbaSPARDA 的基础结构与 gRNA 结合
NbaSPARDA 由 NbaAgo（含 MID 和 PIWI 结构域）和 DREN-APAZ（含 DREN 核酸酶结构域、桥接环和 APAZ 结构域）组成。在空载状态下，二者形成异源二聚体（图 1a）。当结合 21 nt 的 gRNA 后，系统通过 APAZ-APAZ 和 Ago-Ago 界面发生二聚化，形成四聚体结构（图 1b）。此时 gRNA 的 5' 端（前 5 个核苷酸）通过 MID 结构域的亲水相互作用特异性识别 5'- 磷酸基团和 5'-AU 基序，而 MID/PIWI 结构域与 2'- 羟基的氢键作用确保优先结合 RNA 向导，解释了其对 gRNA 的偏好性。
靶 DNA 识1别与 filament 组装的触发
当遇到互补的靶 ssDNA 时，NbaSPARDA 的激活依赖于 gRNA-tDNA 异源双链的长度和中央互补性。若 tDNA 仅 13 nt，异源双链长度不足（<8 bp），二聚体解离为单体（图 1c）；而 21 nt 的 tDNA 可诱导形成螺旋状 filament，呈现 “外层骨架 - 内层核心” 结构：NbaAgo 构成骨架，APAZ 结构域和异源双链锚定在外层，DREN 结构域在核心区发生四聚化（图 1d-e）。这种组装方式使 DREN 的催化口袋（如 DREN.2、DREN.3）朝向 filament 内部，协同结合底物 ssDNA/dsDNA，激活非特异性核酸酶活性。
核酸酶活性24的分子基础与功能意义
DREN 结构域的四聚化是激活的关键：四个催化结构域中，两个面向 filament 核心结合底物，另两个朝向溶剂稳定分子构象。桥接环在 DREN 与 APAZ 之间的动态调节作用，确保只有在完整异源双链存在时才触发酶活。这种机制使得 NbaSPARDA 能够非特异性降解入侵核酸及宿主基因组，通过 “细胞自杀” 策略阻止噬菌体扩散，实现群体水平的免疫保护。
进化保守性35与系统普遍性
同源的 XauSPARDA（Xanthobacter autotrophicus Py2）、EaeSPARDA（Enhydrobacter aerosaccus）等 S2B 枝系统在结合 gRNA/tDNA 后均形成类似 filament 结构，且 DREN 结构域四聚化模式保守，提示 “单体 - 二聚体 - filament” 的激活机制在 SPARDA 系统中广泛存在。
研究结论与6意义
本研究通过多维度结构生物学和生化分析，阐明了 SPARDA 系统依赖 gRNA-tDNA 异源双链驱动 filament 组装的激活机制，揭示了短 pAgos 通过超分子组装实现功能切换的动态过程。这一发现不仅填补了细菌 RNA 引导防御机制的理论空白，还为理解原核生物与入侵遗传元件的 “军备竞赛” 提供了新视角。
从应用层面看，NbaSPARDA 的核酸酶活性具有高灵敏度（检测限低至 150 pM），结合预扩增技术可检测低至 30 分子的靶标，为开发新型核酸检测工具（如病原体快速诊断）提供了天然模板。此外，其 “自杀式防御” 的设计3原理或可启发人工合成生物学系统，用于工程菌的可控死亡开关或基因编辑安全机制。
值得注意的是，细菌防御系统中类似真核免疫复合物的超分子组装现象，提示了生物防御策略的趋同进化。尽管 filament 结构的可逆性、宿主内生理功能等问题仍待探索，本研究为细菌免疫领域开辟了新方向，有望推动抗菌疗法与生物技术的交叉创新。
