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C-H 鍵官能團化面臨區域和立體選擇性挑戰，尤其惰性脂肪族 C-H 鍵。研究人員探討自行車黴素合成中三種 Fe (II)/α- 酮戊二酸依賴雙加氧酶（αKGDs）機制，發現其用互正交策略實現不同區域選擇性，拓展生物催化劑工具箱。
论文解读
在化學合成領域，碳氫（C-H）鍵官能團化猶如一把開啟分子多樣性大門的鑰匙，被廣泛用於構建天然產物和有機分子。然而，當面對惰性脂肪族（sp3）C-H 鍵時，如何精準控制反應的區域選擇性和立體選擇性，一直是困擾科學家的難題。這些頑強的 C-H 鍵猶如頑固的堡壘，其高解離能使得反應難以定向進行，傳統化學催化方法往往需要藉助底物固有反應性、導向基團或過渡金屬催化劑，但在選擇性控制上仍有諸多局限。與此同時，酶催化雖能通過活性位點對底物 C-H 鍵的精確識別展現優異選擇性，卻因缺乏精確的酶 - 底物複合物結構信息和能量計算，難以建立可預測的選擇性模型。因此，揭示酶催化 C-H 鍵活化的機制，開發具有可預測性的選擇性模型，成為推動該領域發展的關鍵。
為攻克這一難題，中國科學院分子植物科學卓越創新中心、上海有機化學研究所、江南大學等國內研究機構的研究人員，聚焦於自行車黴素（bicyclomycin, BCM）生物合成過程，開展了一項富有開創性的研究。他們將目光鎖定於三種 Fe (II)/α- 酮戊二酸依賴雙加氧酶（αKGDs）——BcmE、BcmC 和 BcmG，深入探究其在類似底物（環二肽）特定 C-H 鍵羥基化中的作用機制。研究發現，這三種酶猶如精密的分子工匠，分別採用互正交的策略，實現了對不同 C-H 鍵的選擇性羥基化，為解決 C-H 鍵區域選擇性官能團化難題提供了嶄新視角。該研究成果發表在國際權威學術期刊《Nature Communications》上，為生物催化和化學合成領域開闢了新的研究方向。
研究人員綜合運用多種先進技術手段揭示酶催化機制。首先，通過晶體學研究（crystallographic studies）解析了酶與底物複合物的精細結構，猶如獲得分子級別的「高清照片」，直觀呈現酶活性位點與底物的相互作用。其次，藉助密度泛函理論（DFT）計算，從量子力學層面模擬氫原子抽象過程的能量勢壘，猶如搭建虛擬實驗室，預測不同反應路徑的可行性。此外，定點突變（site-directed mutagenesis）實驗則通過改造酶蛋白關鍵殘基，驗證了結構分析和計算模擬的結論，確認了影響選擇性的關鍵因素。
結果
BcmE、BcmG 與 BcmC 控制位點選擇性策略差異
DFT 計算顯示，在截短理論酶模型中，BcmC 催化的 C-2’氫原子抽象活化自由能最低（5.1 kcal mol-1），表明其選擇性主要依賴底物固有反應性。然而，BcmE 和 BcmG 催化的位點（C-7 和 C-3’）固有反應性較低，暗示酶蛋白骨架對選擇性起決定性作用。
酶結構特徵與位點選擇性關聯
晶體結構分析發現，三種酶雖共享保守「果凍卷」核心結構，但 C 末端螺旋和活性口袋形狀差異顯著。BcmE 的活性口袋由 F273、T307、Y308 等殘基形成疏水腔，通過空間位阻（steric hindrance）強制底物 C-7 靠近鐵中心；BcmC 的活性口袋較大，底物 2 的 DKP 環通過疏水作用鑲嵌其中，其選擇性取決於底物固有反應性；BcmG 則通過 Y288 與底物 3 的 2’-OH 形成氫鍵，猶如分子「導向標」，驅動 C-3’處於催化活性構象。
位點選擇性機制解析
MD 模擬和定點突變實驗進一步揭示：BcmE 通過 Y120、V304 等殘基的范德華相互作用構建受限腔體，實現空間位阻控制策略；BcmC 依賴底物 2 中 C-2’鍵的固有高反應性，體現底物固有控制策略；BcmG 則藉助氫鍵網絡和疏水作用，模擬化學催化中的導向基團控制策略，逆轉底物固有選擇性。
機制指導下的 C-H 羥基化應用
底物拓展實驗表明，BcmE 專一識別異亮氨醯環二肽，羥基化 C-7 位點；BcmC 特異性作用於亮氨醯環二肽的 C-2’位點（叔碳）；BcmG 偏好毗鄰羥基的位點，實現可編程 C-H 羥基化，為多樣化環二肽合成提供生物催化工具。
結論與討論
本研究系統闡明了 BcmE、BcmC 和 BcmG 在自行車黴素生物合成中實現區域選擇性 C-H 羥基化的分子機制，揭示了空間位阻控制、底物固有控制和導向基團控制三種互正交策略。這些發現不僅為理解 αKGDs 家族酶的選擇性機制提供了範例，更為化學合成中惰性 C-H 鍵的定向官能團化提供了嶄新策略。與傳統化學催化需引入和移除導向基團不同，天然酶通過底物與活性位點的精細相互作用實現選擇性，為開發綠色、高效的生物催化劑奠定了基礎。未來，基於這些機制的酶工程改造有望實現分子編輯的終極目標 —— 在有機分子任意位點、以任意順序進行精準修飾，推動藥物合成、天然產物開發等領域的革命性進展。
本研究不僅是生物催化領域的重要突破，更為跨學科研究提供了典範。通過結晶學、計算化學和分子生物學技術的有機結合，研究人員猶如擁有了「分子望遠鏡」和「計算引擎」，得以在原子層面解析酶催化的奧秘。這些成果不僅豐富了我們對生物合成機制的認識，更為解決化學合成中的關鍵科學問題開闢了新途徑，展現了基礎研究向應用轉化的巨大潛力。
