编辑推荐：
为解决褐藻糖胶酶催化效率低、热稳定性差等问题，研究人员对 Mariniflexile fucanivorans 的 GH107 家族褐藻糖胶酶 FcnA 开展理性设计改造。筛选出多种突变体，其中 L46R/Y290F/N374D 活性达野生型 2.67 倍，热稳定性显著提升，为工业用酶开发提供新策略。
论文解读
研究背景
在海洋生物资源开发的浪潮中，岩藻聚糖（fucoidan）作为一种广泛存在于褐藻和海洋无脊椎动物中的硫酸化多糖，因其具备抗菌、抗癌、抗氧化等多重生物活性，在食品、医药领域展现出巨大潜力。然而，岩藻聚糖的功能活性与其分子量密切相关，低分子量（<10 kDa）的岩藻聚糖寡糖水溶性和生物利用度更优。传统化学降解法依赖强酸或高温条件，易导致糖链脱硫酸化和糖苷键断裂，破坏生物活性；而酶解法凭借温和、高效、特异性强的优势，成为制备功能性寡糖的理想选择。
目前，岩藻聚糖酶（fucoidanase）作为催化岩藻聚糖降解的关键工具酶，主要分为 GH107、GH168 等家族。其中，GH107 家族的内切岩藻聚糖酶研究较为广泛，但多数酶存在催化效率低、热稳定性差、底物特异性受限等问题，严重制约了其在工业生产中的应用。例如，部分酶仅能特异性水解特定来源的岩藻聚糖，且在异源表达系统中活性衰减明显。因此，通过分子工程手段改造岩藻聚糖酶，提升其催化性能和环境适应性，成为突破产业瓶颈的关键方向。
为攻克上述难题，来自相关研究机构的科研团队针对 Mariniflexile fucanivorans 来源的 GH107 家族岩藻聚糖酶 FcnA 展开研究，相关成果发表于《Food Bioscience》。研究通过计算机辅助理性设计，对 FcnA 进行定向突变，系统优化其催化效率和热稳定性，为高性能岩藻聚糖酶的开发提供了新范式。
关键技术方法
研究主要采用以下技术手段：
- 序列比对与突变位点筛选：利用 Clustal Omega 服务器对 5 种细菌岩藻聚糖酶进行多序列比对，结合计算机辅助设计，筛选出 17 个潜在突变热点，最终确定 L46R、Y290F、D361T、N374D 等关键位点。
- 组合突变与酶活性分析：构建单突变体、双突变体（L46R/Y290F、D361T/N374D）及三突变体（L46R/Y290F/N374D），通过酶活性测定筛选高性能突变体。
- 动力学与稳定性表征：利用酶动力学分析（测定 kcat/Km值）评估催化效率，通过热稳定性实验（如温度耐受性测试）分析突变对酶结构稳定性的影响。
- 分子机制解析：借助表面静电势分析、分子间作用力计算及分子动力学（MD）模拟，从结构层面阐释突变体性能提升的机制。
研究结果
1. 突变体筛选与酶活性提升
通过理性设计，研究获得 7 种改良突变体，包括 4 个单突变体、2 个双突变体和 1 个三突变体。其中，三突变体 L46R/Y290F/N374D 的酶活性较野生型（WT）提升 2.67 倍，成为催化效率最高的变体。双突变体 L46R/Y290F 和 D361T/N374D 的活性分别为野生型的 1.9 倍和 1.8 倍，显示出组合突变的协同效应。
2. 热稳定性显著改善
所有组合突变体的热稳定性均显著优于野生型，其中 L46R/Y290F/N374D 的稳定性提升最为显著。表面静电势分析表明，突变通过增强分子间离子键和氢键作用，减少了蛋白质表面的静电斥力，从而提高结构刚性。分子动力学模拟进一步证实，突变后酶分子的均方根波动（RMSF）降低，结构稳定性增强。
3. 酶学特性的多样性改变
单突变体 D361T/N374D 的最适 pH 由野生型的 7.5 shifted 至 6.0，拓宽了酶的 pH 适用范围。金属离子效应实验显示，Fe2+可显著增强突变体的酶活性，为实际应用中优化反应条件提供了依据。
4. 催化效率的动力学验证
动力学参数显示，L46R/Y290F 和 L46R/Y290F/N374D 的 kcat/Km值分别为 122.97 mL?s-1·mg-1和 131.33 mL?s-1·mg-1，约为野生型（64.3 mL?s-1·mg-1）的 2 倍，表明突变体对底物的亲和力和催化效率显著提升。
研究结论与意义
本研究通过理性设计策略成功改造了 GH107 家族岩藻聚糖酶 FcnA，获得了兼具高催化效率与热稳定性的突变体，其中 L46R/Y290F/N374D 成为性能最优变体。机制研究表明，突变通过优化表面静电势、增强分子间作用力及提升结构刚性，实现了酶性能的多维度优化。此外，突变体在 pH 适应性和金属离子响应性方面的改变，进一步拓展了其工业应用场景。
该研究不仅为岩藻聚糖酶的分子工程提供了可借鉴的技术路径，也为其他工业酶的定向改造提供了理论参考。未来，基于结构 - 功能关系的精准酶设计，有望推动海洋多糖高效降解体系的建立，加速岩藻聚糖在功能食品、生物医药等领域的产业化进程。
