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为应对猴痘病毒（MPXV）快速检测需求，研究人员开发 LAMP-CRISPR/Cas12b 一步法检测体系。该法 40 分钟内完成检测，灵敏度达 6.5 拷贝 / 反应，临床样本中与 qPCR 一致率 100%，为资源有限地区提供便携高效的 POCT 方案。
猴痘（Monkeypox）是由猴痘病毒（MPXV）引发的人畜共患病，其典型症状包括发热、皮疹和淋巴结肿大。自 2022 年起，猴痘疫情呈现全球扩散态势，世界卫生组织数据显示，2022 至 2024 年全球 128 个成员国报告了超 12 万例实验室确诊病例。传统检测方法如病毒培养、PCR 等依赖专业设备和技术人员，耗时长，难以满足现场快速检测需求。开发一种简便、灵敏且适用于资源有限地区的检测技术，成为遏制病毒传播的关键。
在此背景下，江苏省疾病预防控制中心的研究人员开展了相关研究，成果发表在《Virology Journal》。他们建立了一种将环介导等温扩增（LAMP）与 CRISPR/Cas12b 系统整合的一步法检测平台，实现了猴痘病毒的快速可视化检测，为猴痘的现场即时诊断提供了新方案。
研究采用的关键技术方法包括：①临床样本采集：收集江苏省 2023 年 6 月至 2024 年 6 月期间 113 例疑似猴痘病例的皮疹液和咽拭子样本，依据国家卫生健康委员会指南进行流行病学和临床标准筛选；②LAMP 引物与 gRNA 设计：针对 MPXV 保守的 F3L 基因设计 5 组 LAMP 引物和 5 条 gRNA，通过筛选确定最优组合（PS5 引物和 gRNA5）；③一步法体系构建：在同一反应管内整合 LAMP 扩增与 CRISPR/Cas12b 检测，优化反应缓冲液比例、温度、酶浓度等参数，并引入甘氨酸和牛磺酸增强信号；④性能验证：通过数字 PCR 定量病毒 DNA，评估检测灵敏度、特异性，并与 qPCR 在临床样本中进行对比。
结果
LAMP 引物与 gRNA 筛选
通过实时浊度监测，PS5 引物对 MPXV DNA 的扩增启动时间最短，且阴性对照无信号。在两步法检测中，gRNA5 诱导的 Cas12b 切割活性最高，荧光信号最强，故选定 PS5 和 gRNA5 用于后续实验。
一步法检测条件优化
确定最佳反应条件为：0.5×LAMP 预混液与 0.5×CRISPR 缓冲液混合，60℃孵育 40 分钟，Cas12b/gRNA 浓度 0.2μM，ssDNA 报告子浓度 0.25μM，添加 0.25M 甘氨酸或 0.1M 牛磺酸可增强信号。该体系无需开盖操作，避免交叉污染。
灵敏度与特异性
检测限（LOD）经 probit 回归分析确定为 6.5 拷贝 / 反应。10 倍梯度稀释实验显示，10 拷贝模板在 20 分钟内即可产生荧光信号，40 分钟时肉眼可通过蓝光或紫外光观察到绿色荧光。与单纯 LAMP 相比，整合 CRISPR/Cas12b 显著提升特异性，对 HSV、EBV 等 5 种易混淆病原体均无交叉反应。
临床样本验证
在 113 例临床样本中，该方法与 qPCR 的灵敏度和特异性均达 100%（71/71，42/42）。阳性样本的荧光阈值时间均低于 20 分钟，且肉眼可视化结果与荧光检测一致，验证了其临床适用性。
结论与讨论
该研究开发的一步法 LAMP-CRISPR/Cas12b 检测体系，兼具 LAMP 的高效扩增能力与 CRISPR/Cas12b 的高特异性，检测全程仅需 40 分钟，且所需设备仅为便携加热模块和蓝光 / 紫外光源，适合在机场、疫区等资源有限场景部署。与现有方法相比，其灵敏度优于多数等温检测技术，可视化信号稳定性强，可维持数日，降低了肉眼判读的误判风险。
研究首次在临床样本中验证了该体系的可靠性，但仅针对 MPXV II 型毒株。未来需纳入 I 型毒株样本进一步验证，并探索免核酸提取技术对检测性能的影响，以进一步提升其现场应用的便捷性。总体而言，该平台为猴痘及其他传染病的即时分子诊断提供了通用框架，具有重要的临床转化价值和公共卫生意义。
