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庆大霉素（GEN）作为广谱氨基糖苷类抗生素，其合成路径和培养条件优化研究有限。本研究对比 GEN 与福提霉素、卡那霉素的生物合成基因簇，利用 D - 最优设计（DOD）优化环境因素，使 GEN 产量提升 13.5 倍，为工业化生产提供关键参数。
庆大霉素（Gentamicin, GEN）是由紫色小单孢菌（Micromonospora purpureochromogenes）产生的 5,6 - 二糖基 - 2 - 脱氧链霉胺氨基糖苷类抗生素（2DOS-AGA），具有广谱杀菌活性，在临床治疗多重耐药（MDR）革兰氏阴性和阳性病原菌感染中发挥重要作用。然而，目前关于其生物合成途径的解析及培养条件对产量影响的研究较为有限，制约了通过代谢工程优化产量的进程。为填补这一空白，来自沙特阿拉伯国王哈立德大学和埃及艾因夏姆斯大学等机构的研究人员，针对 GEN 的生物合成机制及环境因素优化展开研究，相关成果发表于《BMC Microbiology》。
研究团队首先对 GEN 的生物合成基因簇（GenBank 登录号 AJ628149.4）进行测序和注释，并与福提霉素（Fortimicin, FTM）、卡那霉素（Kanamycin, KAN）的基因簇（登录号分别为 AJ628421、AJ628422）进行比对分析。通过 FramePlot 2.3.2 软件和 BLAST 工具，发现 GEN 基因簇与 FTM、KAN 基因簇存在部分保守区域，推测其生物合成可能融合了两者的途径。
在工艺优化方面，研究采用响应面法中的 D - 最优设计（D-Optimal Design, DOD），对初始 pH、培养温度、搅拌速率和培养时间 4 个关键因素进行统计学优化。以 CM4 培养基为基础，通过 23 次实验构建二次模型，并利用 HPLC 验证产量变化。
关键技术方法
- 基因簇分析：通过 FramePlot 2.3.2 软件识别开放阅读框（ORF），利用 BLASTn 和 BLASTp 进行序列比对，分析基因功能及同源性。
- 产量测定：采用抑菌圈法（IZ）测定抗菌活性，结合 HPLC（配备 C18 色谱柱，检测波长 260 nm）定量 GEN 浓度，以标准曲线计算产量。
- 统计优化：使用 Design Expert v.7 软件构建 DOD 模型，通过方差分析（ANOVA）评估因素显著性，确定最优条件。
研究结果
1. 生物合成途径解析
- 基因簇比对：GEN 基因簇与 FTM 的 forHIJ 区域、KAN 的 kanS1CD2M2DS2 区域分别具有 95% 和 97% 的核苷酸序列保守性，表明其合成可能同时利用 FTM 的糖基修饰（如 3',4'- 双脱氢和 6'- 甲基化）和 KAN 的帕罗霉素（Paromomine）中间产物路径。
- 途径推断：基于基因功能注释，提出 GEN 合成始于 2 - 脱氧链霉胺（2DOS）的环醇结构构建，经糖基转移酶（GT）和氨基转移酶（AT）作用，逐步引入糖基和氨基，最终形成具有抗菌活性的 C 复合物（GEN-C）。
2. 培养条件优化
- 培养基筛选：在 7 种培养基中，CM4（M65）和 CM6 表现出最高比生产力（6.36 和 3.80 μg/mg），选择 CM4 作为优化基准。
- DOD 模型验证：最优条件为初始 pH 7.0、温度 30℃、搅拌速率 300 rpm、培养时间 10 天，此时 GEN 产量达 289.5 μg/mL，较基础培养基 CM1（21.4 μg/mL）提升 13.5 倍，较优化前 CM4（123.7 μg/mL）提升 2.4 倍。
3. 模型可靠性验证
- 统计分析：模型 F 值为 11.21（P<0.001），失拟项不显著（P=0.203），决定系数 R2=0.807，表明模型拟合良好。
- HPLC 验证：优化条件下产物保留时间与标准品一致（4.5 min），证实产量提升并非由其他代谢物干扰所致。
结论与讨论
本研究首次系统揭示了庆大霉素生物合成途径与福提霉素、卡那霉素的关联性，证明其可能通过基因簇融合获得双重代谢路径。D - 最优设计模型的成功应用，不仅为庆大霉素的工业化生产提供了关键工艺参数（如 300 rpm 搅拌速率显著提升传氧效率），还为其他氨基糖苷类抗生素的代谢工程优化提供了方法论参考。研究结果表明，组合生物合成策略（如跨物种基因簇重组）有望开发新型抗菌衍生物，应对日益严峻的多重耐药菌挑战。此外，优化条件在放大培养中的应用需进一步考虑传质限制和代谢流分配，为后续中试研究奠定了理论基础。
