CloseRead工具：长读长基因组组装中免疫球蛋白位点错误评估与校正的新方法

为解决复杂基因组区域（如免疫球蛋白IG位点）在长读长测序组装中的准确性问题，研究人员开发了CloseRead工具，通过多指标可视化评估74种脊椎动物基因组组装质量，发现58.1%的IGH位点存在错误，并通过局部重组装成功校正。该研究为基因组组装质量控制和复杂区域精准解析提供了新方法，发表于《Genome Biology》。

　　

基因组组装技术的进步使得长读长测序（如PacBio HiFi）能够跨越复杂重复区域，但免疫球蛋白（Immunoglobulin, IG）位点因其高度重复性和结构复杂性仍是组装难点。IG位点包含抗体编码基因（IGH、IGK、IGL），其V(D)J重组机制对免疫多样性至关重要。然而，现有评估工具（如QUAST、BUSCO）难以检测IG位点的组装错误，且单倍型未解析（haplotype-unresolved）组装中错误率更高。这一问题限制了免疫基因组学研究和跨物种比较。

为解决这一挑战，来自美国宾夕法尼亚州立大学、康奈尔大学等机构的研究团队开发了CloseRead工具，系统评估了74种脊椎动物（61种哺乳动物和13种爬行动物）基因组中IG位点的组装质量，发现58.1%的IGH位点存在序列缺失或覆盖断裂。通过De Bruijn图分析和局部重组装，研究人员成功校正了墨西哥灰狼（Canis lupus baileyi）1.5 Mb的倒位错误，并补充了北极狼（Canis lupus orion）和菲律宾鼯猴（Cynocephalus volans）缺失的IG序列。该研究发表于《Genome Biology》，为复杂基因组区域的精准组装提供了方法论突破。

关键技术包括：1）基于Minimap2的HiFi reads比对；2）IgDetective工具注释IG基因；3）双视角（read-oriented和basepair-oriented）错误量化；4）La Jolla Assembler（LJA）生成De Bruijn图指导重组装；5）跨物种组装质量统计（覆盖度、错配率等）。

结果

方法学概述
CloseRead通过比对HiFi reads与组装序列，结合IgDetective定位IG位点边界，检测错配（>1%差异）和覆盖断裂（<2 reads支持），最终通过可视化报告错误区域。

错误类型分析
在74个物种中，50%的单倍型未解析组装存在IG位点序列缺失（如北极狼alternate haplotype缺失1.4 Mb），而57.7%的单倍型解析（haplotype-resolved）组装存在覆盖断裂。墨西哥灰狼的覆盖断裂揭示了1.5 Mb倒位错误，经LJA重组装后纠正。

案例研究

1. 序列缺失：北极狼和菲律宾鼯猴的alternate haplotype分别缺失69和77个IG基因，经De Bruijn图分析补充后，基因支持率提升至100%。
2. 覆盖断裂：墨西哥灰狼的8 kb覆盖断裂与端粒重复序列（CCCTAA）错误连接相关，校正后组装连续性显著改善。

讨论与意义
该研究揭示了现有基因组组装在IG位点的系统性缺陷，尤其是单倍型未解析组装中高达50%的序列缺失率。CloseRead的创新性在于：1）突破现有工具（如CRAQ）对“完整组装”的假设，能检测部分单倍型缺失；2）结合De Bruijn图实现错误溯源。研究为免疫基因组学、疫苗开发和跨物种进化分析提供了高质量数据基础，并倡导迭代组装（iterative assembly）策略以提升复杂区域准确性。未来需进一步自动化该流程并整合至主流组装管线（如VGP）。