基于 mRNA-LNP 的瞬时 prime 编辑技术治疗小鼠代谢性肝病的研究

为解决苯丙酮尿症（PKU）等遗传肝病的治疗难题，研究人员开发肝特异性瞬时 prime 编辑技术，通过双重递送（AAV 表达 pegRNA+LNP 递送 PE mRNA）及全 RNA-LNP 递送策略，在 Pahenu2小鼠模型中实现基因校正率最高 20.7%，显著降低血苯丙氨酸水平，为临床转化提供高效平台。

　　

研究背景与意义

苯丙酮尿症（PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变引起的常染色体隐性代谢性肝病。患者因无法正常代谢苯丙氨酸，可导致严重智力障碍、小头畸形等。尽管现有饮食限制和酶替代疗法可改善生存，但患者仍面临学习障碍和生活质量负担，因此亟需能永久恢复肝细胞 PAH 表达的治疗手段。传统基因添加疗法虽能补充功能基因，但依赖持续 DNA 递送；而基于 CRISPR 的基因组编辑技术（如碱基编辑、prime 编辑）因可直接修复致病突变，成为研究热点。然而，早期 CRISPR-Cas9 依赖同源定向修复（HDR），在肝脏中效率不足 1%；碱基编辑虽能降低苯丙氨酸水平，但仅适用于特定类型点突变。prime 编辑（PE）作为新型基因组编辑技术，无需 DNA 双链断裂和 HDR，理论上可纠正任意小片段遗传变异，但早期体内研究显示其编辑效率较低（如 RNA-LNP 递送时编辑率低于 8%），且病毒载体介导的持续表达可能引发脱靶风险和免疫反应。因此，开发高效、安全的瞬时 prime 编辑策略对治疗 PKU 等遗传肝病至关重要。

瑞士苏黎世大学（University of Zurich）的研究团队在《Nature Biomedical Engineering》发表研究，开发了两种肝脏特异性瞬时 prime 编辑方法，通过优化递送系统和编辑组件，显著提升了基因校正效率，为临床转化提供了关键突破。

主要技术方法

研究采用两种核心策略：

1. 双重递送系统：利用腺相关病毒（AAV）持续表达 prime 编辑向导 RNA（pegRNA），同时通过脂质纳米颗粒（LNP）瞬时递送 prime 编辑器（PE）mRNA。AAV 选用肝靶向血清型 AAV2/9，PE 采用优化变体 PEmax 和 PE7（融合 RNA 结合蛋白 La 以增强 pegRNA 稳定性）。

2. 全 RNA-LNP 递送：将 PE mRNA 与化学修饰的 pegRNA 共包裹于 LNP，通过多次给药实现瞬时编辑。
   关键技术包括：合成核苷修饰的 mRNA 以降低免疫原性、pegRNA 的 2'-O - 甲基化等化学修饰增强稳定性、下一代测序（NGS）检测编辑效率及脱靶效应，以及苯丙氨酸水平测定验证治疗效果。

研究结果

1. AAV-LNP 双重递送策略的优化

• PEmax 的应用：在 HEK293T 细胞中，通过优化 pegRNA 的 3' 端伪结结构（tevopreQ1 修饰）和原间隔相邻基序（PAM）沉默突变，PEmax 将 Pah^enu2位点的校正率从早期研究的 < 1% 提升至 4.6%，并降低插入缺失（indel）率。体内实验显示，单次 AAV2/9 递送 pegRNA 联合三次 LNP-PEmax mRNA 给药，使 Pah^enu2小鼠的基因校正率达 4.3%，血苯丙氨酸水平从 > 1500 μmol/L 降至 623.7 μmol/L（接近成人治疗阈值 600 μmol/L）。

• PE7 的突破：引入 PE7（含 La 蛋白）后，编辑效率显著提升。单次 LNP-PE7 mRNA 给药在 Dnmt1 位点实现 47.4% 编辑率，三次给药在 Pah^enu2位点达 20.7% 校正率，血苯丙氨酸水平降至 342 μmol/L，低于儿童治疗阈值 360 μmol/L。

2. 全 RNA-LNP 递送策略的验证

• 化学修饰 pegRNA 的作用：通过 5' 端 2'-O - 甲基 - 3''- 硫代磷酸酯和 3' 端磷酸乙酸修饰，合成 pegRNA 的稳定性增强。两次 LNP 共递送 PE7 mRNA 与 pegRNA，在 Dnmt1 位点实现 35.9% 编辑率；三次给药在 Pah^enu2位点达 8.0% 校正率，同样将苯丙氨酸水平降至治疗阈值以下。

• 多突变适用性：针对 11 种常见 PKU 突变，利用 PRIDICT2.0 预测高效 pegRNA，在 K562 报告细胞中验证显示，8 种突变的编辑率高于 Pah^enu2位点，提示该技术对多种 PKU 亚型的潜在疗效。

3. 安全性与特异性评估

• 脱靶效应：在肝外组织（如肾、脾、肌肉）及预测的脱靶位点，未检测到显著编辑；CHANGE-seq 分析显示，治疗组与对照组的脱靶率无统计学差异。

• 毒性反应：LNP 或 AAV 给药后，血清丙氨酸转氨酶（ALT）和炎症因子（如 MCP1、IFNγ）短暂升高，但迅速恢复基线，肝组织学未显示坏死，证实该策略的安全性。

结论与讨论

本研究通过瞬时递送策略（AAV-LNP 双重系统或全 RNA-LNP）结合优化的 prime 编辑组件（如 PE7），在 PKU 小鼠模型中实现了高效、安全的基因校正，显著降低病理指标。其中，PE7 通过融合 La 蛋白增强 pegRNA 稳定性，成为提升编辑效率的关键创新。双重递送系统虽需两种载体，但编辑效率更高，适用于需要高校正率的疾病；而全 RNA-LNP 策略更易规模化生产，适合重复给药。此外，研究显示该技术对多种 PKU 突变有效，为个性化治疗提供了可能。

与碱基编辑相比，prime 编辑的优势在于可纠正更广泛的突变类型，突破了过渡型点突变的限制；与传统基因疗法相比，瞬时递送避免了持续表达编辑组件的潜在风险。尽管 AAV 载体的免疫原性和长期安全性仍需临床验证，但本研究为肝遗传性疾病提供了可扩展的治疗平台，有望推动 prime 编辑向临床转化，特别是针对目前缺乏有效疗法的单基因代谢病。未来研究可进一步优化 LNP 配方，提升递送效率，并探索其在其他器官的应用潜力。