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为解决肿瘤免疫治疗响应率低的问题，研究人员开展抗 DKK1 抗体的发现及机制研究。利用噬菌体展示库结合机器学习，筛选出靶向 hDKK1 不同结构域的抗体，发现 CRD1 抗体激活非经典 Wnt 通路，具抑瘤潜力，为肿瘤免疫治疗提供新方向。
论文解读
在肿瘤的发展进程中，免疫系统与肿瘤细胞之间的博弈从未停歇。肿瘤细胞通过降低自身抗原性和免疫原性等复杂机制，巧妙地逃避免疫系统的识别与攻击，使得当前的免疫治疗手段，如靶向 PD-L1、CTLA-4 的免疫检查点抑制剂以及 CAR-T 细胞疗法等，仅能使少数癌症患者获得持久应答。因此，寻找新的免疫治疗靶点和策略，以提高治疗响应率、增强现有疗法的临床效果，成为亟待解决的重要科学问题。
在这样的背景下，美国 Twist Bioscience 公司的研究人员聚焦于 Wnt 信号通路展开研究。Wnt 信号通路在胚胎发育和肿瘤发生中起着关键作用，可分为依赖 β- 连环蛋白（β-catenin）的经典通路和不依赖 β- 连环蛋白的非经典通路。DKK1（Dickkopf-1）作为 Wnt 信号的强效抑制剂，通过与 Wnt 竞争性结合 LRP5/6 共受体来抑制经典通路。越来越多的证据表明，DKK1 不仅在多种癌症中具有致瘤性，还能通过积累骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）诱导肿瘤逃避免疫监视，因此成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。该研究团队希望通过开发靶向 DKK1 的抗体，探索其在肿瘤治疗中的应用价值。相关研究成果发表在《Oncogene》上。
研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。首先，利用 Twist 的精准 DNA 写入技术构建了多样性超过 1×101?个成员的噬菌体展示库，并借助机器学习模型优化抗体筛选。通过生物素化 DKK1 蛋白进行四轮噬菌体筛选，结合 K 近邻（KNN）分类算法和卷积神经网络（CNN）等机器学习方法对克隆进行选择和排序，最终获得高亲和力的抗体候选分子。此外，还运用了表面等离子体共振（SPR）技术分析抗体与 DKK1 的结合动力学和表位分布，通过 PLIMB-HRF 方法进行表位映射，并利用多种细胞功能实验（如 TCF/LEF 报告基因检测、JNK 磷酸化检测、NK 细胞活化实验和肿瘤细胞毒性实验等）以及体内荷瘤小鼠模型评估抗体的生物学活性和抑瘤效果。
研究结果
抗 DKK1 抗体的表位分布与结合特性
通过 SPR 表位分箱和表位映射实验发现，筛选出的抗体分为两个表位组。Bin1 抗体（如 SC52-002 和阳性对照抗体）结合 DKK1 的 C 端半胱氨酸富集结构域 2（CRD2），而 Bin2 抗体（如 SC52-005、TB643-070 等）结合 N 端半胱氨酸富集结构域 1（CRD1）。部分抗体还表现出对食蟹猴和小鼠 DKK1 的交叉反应性，显示出潜在的跨物种应用潜力。
CRD2 结合抗体恢复 Wnt 经典通路
在 Wnt 经典通路的研究中，CRD2 结合抗体能够阻断 DKK1 与 LRP5/6 共受体的结合，使 Wnt 重新与 LRP5/6 结合，从而恢复 TCF/LEF 信号传导，并促进成骨细胞分化。在 MC3T3-E1 小鼠前成骨细胞的矿化实验中，这类抗体可逆转 DKK1 对成骨细胞分化的抑制作用，表明其在骨代谢相关疾病中可能具有治疗价值。
CRD1 结合抗体激活 Wnt 非经典通路与免疫应答
CRD1 结合抗体则通过激活 Wnt 非经典通路中的 JNK 磷酸化，促进免疫细胞活化。在 Colo205 结肠癌细胞的 JNK 磷酸化检测中，这类抗体可恢复因 DKK1 抑制而减弱的 JNK 磷酸化水平。进一步的免疫细胞实验表明，CRD1 抗体能显著诱导 NK 细胞分泌 GM-CSF，并增强人外周血单个核细胞（PBMCs）对 PC3 前列腺癌细胞、SKBR3 乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞的杀伤能力，显示出其通过激活免疫应答抑制肿瘤的潜力。
双特异性抗体增强双重通路激活
为进一步提高治疗效果，研究人员构建了同时结合 DKK1 CRD1 和 CRD2 的双特异性抗体（如 TB725-007）。这类抗体既能恢复 Wnt 经典通路的信号传导，又能激活免疫细胞应答，在肿瘤细胞毒性实验中表现出比单特异性抗体更强的杀瘤效果，为开发更高效的肿瘤治疗药物提供了新策略。
体内抑瘤效果与安全性评估
在 SCID 小鼠的 PC3 肿瘤模型中，CRD1 结合的双特异性抗体 TB725-003 表现出显著的抑瘤效果，与同型对照和阳性对照抗体相比，肿瘤生长抑制率分别达到 42.89% 和 44.75%，且能增加肿瘤微环境中 NK 细胞的数量。在人源化 DKK1 小鼠（B-hDKK1）的毒性评估中，候选抗体 TB643-070 未引起明显的体重下降和肝毒性，显示出较好的安全性。
研究结论与意义
本研究通过多维度的发现策略，成功筛选出靶向 DKK1 不同结构域的功能性抗体，揭示了 DKK1 的 CRD1 和 CRD2 分别在调控 Wnt 非经典通路和经典通路中的关键作用。CRD1 结合抗体通过激活 Wnt 非经典通路和免疫应答展现出强大的体内抑瘤活性，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点和作用机制。同时，双特异性抗体的设计为增强治疗效果、克服单一通路抑制的局限性提供了新思路。这些发现不仅深化了对 DKK1 在肿瘤和免疫调控中复杂作用的理解，也为开发更有效的肿瘤治疗药物，尤其是针对免疫治疗响应不佳的患者，开辟了新的研究方向。未来，进一步探索 DKK1 抗体与其他免疫治疗手段的联合应用，有望为癌症患者带来更显著的临床获益。
