基于Tau蛋白介导的分裂荧光素酶系统：冠状病毒诱导合胞体形成的高通量定量新方法

本研究针对传统冠状病毒诱导合胞体（syncytia）定量方法通量低、操作繁琐的瓶颈，开发了基于Tau蛋白多聚化介导的分裂高斯荧光素酶（split-Gluc）系统。通过将Gluc片段与Tau蛋白融合，实现了FCoV和SARS-CoV-2感染后细胞融合事件的灵敏检测，证实其与病毒剂量呈强相关性（MIC=0.994），并成功应用于抗病毒药物GS-441524的筛选。该技术为冠状病毒膜融合机制研究及药物开发提供了高效工具。

　　

在病毒学研究中，冠状病毒通过其刺突蛋白（Spike protein）与宿主细胞受体结合，不仅能介导病毒入侵，还能触发细胞间融合形成多核合胞体（syncytia）。这种现象不仅是病毒致病的关键环节，也是抗病毒药物开发的重要靶点。然而，传统合胞体检测方法如显微镜计数或流式细胞术存在通量低、难以量化融合细胞动态变化等局限，严重制约了大规模药物筛选的效率。

日本大学和理化学研究所的研究团队在《Scientific Reports》发表的研究中，创新性地将神经退行性疾病研究中Tau蛋白的自聚集特性与报告基因系统结合。他们构建了分泌型Tau-split Gaussia luciferase（Gluc）系统，当表达Gluc-N端（Gn）和C端（Gc）片段的细胞发生融合时，Tau蛋白的多聚化促使分裂的Gluc片段重构酶活性，通过检测培养基中分泌的荧光素酶信号即可定量细胞融合程度。

关键技术包括：（1）构建分泌型Tau-Gn/Gc融合表达载体；（2）建立稳定表达株Fcwf-stable Tau细胞；（3）优化96/384孔板检测体系；（4）结合时间推移显微术动态观察合胞体形成；（5）采用WST-8法同步检测细胞活性。实验使用猫肾细胞（CRFK）和猫胎儿细胞（Fcwf-4）感染猫冠状病毒（FCoV）或转染SARS-CoV-2刺突蛋白作为模型。

结果部分
培养液中split-Gluc活性恢复与检测
通过C端融合策略（ssTau-Gn + ssTau-Gc）获得最高荧光信号，较未感染对照提升>60倍。离心实验证实95%活性存在于上清，验证了分泌特性。在384孔板中仅需0.16×10⁴个细胞即可检测到3.6倍信号增强。

刺突蛋白介导的细胞融合实验
GFP标记的FCoV刺突蛋白（S-GFP）展现出最强融合活性，导致培养12小时后细胞脱落。荧光标记使合胞体形成效率提升238%，而短肽（PA标签）标记仅适度增强。时间推移显微显示单个合胞体形成全程约需3.5小时。

SARS-CoV-2刺突蛋白诱导合胞体
在Vero细胞中，SARS-CoV-2 S蛋白使荧光信号增加4.8倍。猫ACE2与人类ACE2同样显著增强融合效率，证实猫科动物对SARS-CoV-2的易感性。

讨论与结论
该研究突破性地将Tau蛋白多聚化特性应用于病毒学研究，创建了首个无需裂解细胞的合胞体检测方案。其三大优势：（1）直接检测20μL培养基避免细胞脱落干扰；（2）动态范围覆盖128倍稀释；（3）兼容384孔板高通量筛选。在抗病毒评价中，1μM GS-441524即可抑制90%融合活性，且与细胞存活率（WST-8）结果高度一致。

局限性在于无法区分合胞体数量与体积，且Tau多聚化机制可能受其他病毒影响。未来可结合split-Renilla系统实现实时监测。该技术为安全研究高致病性冠状病毒（如无需活病毒即可筛选融合抑制剂）及跨物种传播机制提供了全新工具，尤其对开发广谱抗冠状病毒药物具有重要价值。