基于酚酯的超级多功能Flexizyme系统实现遗传密码重编程的高效拓展

为解决非蛋白原性氨基酸(npAAs)在tRNA氨酰化效率低下的问题，研究人员开发了基于酚酯的flexizyme系统。通过计算pKa预测指导合成五种酚酯，筛选出3-硝基苯酚酯(3NP)作为高效酰基供体，结合优化版eFx催化剂实现了15-41%的氨酰化效率提升，部分环状β-npAAs甚至达到近定量转化。该研究为构建含多重npAAs的肽库及大环肽合成提供了强大工具，发表于《Nature Communications》。

　　

在生物医药领域，如何突破天然氨基酸的限制，将结构多样的非蛋白原性氨基酸(npAAs)高效引入多肽链，一直是开发新型生物活性分子的关键挑战。传统flexizyme技术依赖npAA-苄基(硫)酯(BZEs)作为酰基供体，但存在部分npAAs（如环状β-氨基酸或N-乙酰化脯氨酸）氨酰化效率不足的问题，严重制约了肽库多样性。这一问题在构建含多重npAAs的复杂结构（如大环肽）时尤为突出，成为遗传密码重编程技术发展的瓶颈。

日本的研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，创新性地提出用酚酯替代传统BZEs的策略。通过计算化学工具MolGpka预测酚羟基pKa值，筛选出反应活性适中的3-硝基苯酚酯(3NP)作为新型酰基供体，结合优化的eFx催化剂，成功实现了18种结构迥异的npAAs高效氨酰化。该系统不仅使传统难底物如(1S,2S)-2-氨基环己烷羧酸的tRNA负载率从27%提升至近100%，更首次实现了Ac-L-Pro等顽固性npAAs的可编程引入。

关键技术包括：(1) 基于pKa计算的酚酯分子设计；(2) 微螺旋RNA(μhRNA)酸变性PAGE定量分析；(3) 核糖体翻译系统验证npAA掺入效率；(4) MALDI-TOF MS表征氨酰化产物；(5) EF-P响应型工程化tRNA(如tRNA^ProIE2)的应用。

Poor substrates for flexizymes
研究首先证实传统BZEs系统的局限性：(1S,2S)-2-ACHC-CBT在pH 7.5条件下仅27%产率，而Ac-L-Pro-CBT则完全无法检测到氨酰化产物。通过对比pH 7.5-9.0的反应效率，发现碱性条件虽能提升部分底物产率（如(1S,2S)-2-ACHC-DBE从11%增至17%），但仍低于20%的实用阈值。

Tuning the reactivity of aminoacyl donors
受2-氨基苯甲酸N-羧酸酐(2-Abz-NCA)直接氨酰化启发，团队提出通过调控离去基团pKa优化反应活性。计算显示传统BZEs的pKa值偏高（CBT 9.4，DBE 13.0），而筛选的酚酯（4CP/4AP/3NP/3CP/2FP）pKa介于7.6-8.8，既能避免非特异性酰化，又保证3'-OH选择性反应。

Direct aminoacylation using phenol esters
实验证实3NP酯在pH 7.0、37℃条件下即可实现(1S,2S)-2-ACHC-μhRNA 20-25%产率，相当于传统dFx/DBE系统在pH 9.0、16小时的反应效率。MALDI-TOF MS验证主要产物为单酰化tRNA，且工程化tRNA^ProIE2GGU能准确解码重编程密码子（如ACC）表达目标肽段。

Flexizyme-catalyzing tRNA aminoacylation with npAA-3NPs
突破性发现eFx对3NP酯的广谱催化能力：与(1S,2S)-2-ACHC-3NP组合时，30分钟内实现μhRNA近定量转化，较直接化学氨酰化效率提升3-5倍。该系统成功将18种npAAs的tRNA负载率全部提升至实用阈值（>20%），其中环状β-氨基酸(1S,2S)-2-ACPC达98%。

Multiple incorporations of exotic npAAs into peptides in translation
通过设计含2-5个连续npAA的mRNA模板，验证了系统在复杂肽链合成中的可靠性。例如使用tRNA^ProIE2连续插入5个(1S,2S)-2-ACPC时仍保持单一产物峰。更引人注目的是成功表达含6种npAAs的大环肽P14，包含Tic（四氢异喹啉酸）、Aib（α-氨基异丁酸）等特殊结构单元。

该研究通过"酚酯-eFx"协同策略，解决了遗传密码重编程中关键的效率瓶颈。其重要意义体现在三方面：(1) 为RaPID展示技术提供了更丰富的npAAs肽库；(2) 首次实现Ac-L-Pro等顽固性npAAs的核糖体掺入，拓展了蛋白酶抗性肽设计空间；(3) 3NP酯的温和反应特性使其适用于制备水解稳定的3'-NH-tRNA。未来通过定向进化进一步优化eFx对酚酯的催化特异性，或将开启非天然肽药物开发的新纪元。