编辑推荐：
【编辑推荐】为解决 mRNA-LNP 冻融稳定性及递送效率问题，研究人员开发甜菜碱（BT）- 海藻糖（Trehalose）复合冷冻保护剂（BT-CPA）。发现冻融过程通过冷冻浓缩驱动 BT 掺入 LNP，显著提升内体逃逸和 mRNA 表达，在小鼠中增强免疫应答，为 LNP 制剂提供新策略。
mRNA 疫苗及疗法的核心载体 —— 脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）在储存和应用中面临严峻挑战。mRNA 自身易受水解、氧化和酶解破坏，需零下低温保存，而冻融过程中冰晶形成和渗透压应激会导致 LNP 聚集、融合及 mRNA 泄漏，严重影响稳定性和递送效率。当前常用的冷冻保护剂（Cryoprotectants, CPAs）如蔗糖虽能稳定 LNP 结构，却无法进一步提升递送效能，如何在保障稳定性的同时增强 mRNA 表达，成为制约 LNPs 临床应用的关键瓶颈。
中国科学院化学研究所、理化技术研究所及中国科学院大学的研究团队针对这一难题展开攻关，相关成果发表于《Nature Communications》。团队开发了一种基于甜菜碱（Betaine, BT）的复合冷冻保护剂策略，通过巧妙利用冻融过程中的 “冷冻浓缩” 现象，不仅实现了 LNP 结构的稳定保存，更突破性地提升了 mRNA 递送效率，为 LNPs 的制剂优化开辟了全新路径。
关键技术方法
研究主要采用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）和低温透射电镜（Cryogenic Transmission Electron Microscopy, Cryo-TEM）表征 LNP 的粒径、多分散指数（Polydispersity Index, PDI）及形态结构；利用质子核磁共振（1H-NMR）和高分辨质谱验证 CPA 的掺入；通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析细胞摄取和内体逃逸效率；在 C57BL/6 小鼠模型中评估体内 mRNA 表达及免疫应答，涉及酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶联免疫斑点试验（ELISpot）等免疫学检测技术。
研究结果
1. 甜菜碱复合冷冻保护剂（BT-CPA）稳定 LNP 并提升递送效率
以临床批准的 mRNA-1273 配方制备 LNP，对比研究发现，仅含 PBS 的 LNP 冻融后严重聚集、mRNA 泄漏，递送效率几乎丧失；蔗糖组虽维持结构稳定，但 mRNA 表达无提升；而 BT-CPA（25 mg/mL 甜菜碱 + 25 mg/mL 海藻糖）组 LNP 粒径、PDI 和 mRNA 包封率保持良好，且 mRNA 表达量较新鲜 LNP 提升 2.4 倍，显示甜菜碱与海藻糖的协同作用既能稳定结构，又能增强递送效能。
2. 冷冻浓缩驱动甜菜碱掺入 LNP
通过 1H-NMR 证实，冻融过程中甜菜碱和海藻糖通过冷冻浓缩效应被动扩散进入 LNP 内部，而直接在合成阶段添加 CPA 的对照组几乎无掺入。进一步研究表明，冻融循环次数影响掺入效率：2 次循环时递送效率最佳，6 次循环则因过度掺入导致 LNP 结构破坏。冷冻诱导的脂质相分离和膜缺陷是 CPA 进入的关键机制，冷却速率实验显示较慢冷却（1°C/min）更利于溶质交换。
3. 甜菜碱通过增强内体逃逸提升 mRNA 表达
流式细胞术显示 BT-CPA-LNP 与新鲜 LNP 的细胞摄取能力无显著差异，但共聚焦成像和内体逃逸模型证实，甜菜碱在酸性内体环境中质子化，转化为带正电荷的物种，通过与负电荷内体膜相互作用促进膜融合，显著降低 Cy5 标记 mRNA 与溶酶体的共定位系数（Pearson’s Correlation Coefficient, PCC），提升内体逃逸效率。模型膜融合实验进一步验证了 BT-CPA-LNP 的融合能力增强。
4. BT-CPA-LNP 在小鼠中诱导更强免疫应答
以卵清蛋白（OVA）mRNA-LNP 疫苗免疫 C57BL/6 小鼠，结果显示，无论低剂量（0.1 μg）还是高剂量（1 μg），BT-CPA 冻融组的 OVA 特异性 IgG 抗体滴度及 IFN-γ? CD4?/CD8? T 细胞应答均显著高于新鲜 LNP 组，表明 BT-CPA 策略可在保证免疫原性的同时实现剂量 sparing 优势，为临床疫苗优化提供重要依据。
结论与意义
本研究揭示了冷冻浓缩效应在 LNP 制剂中的双重价值：既通过 CPA 稳定结构，又通过主动掺入功能分子（如甜菜碱）调控 LNP 功能。甜菜碱的双重作用 —— 冷冻保护与内体逃逸增强 —— 突破了传统 CPA 仅作为被动稳定剂的局限，首次证明 CPA 可作为 “活性调节剂” 改善 LNP 的递送性能。这一发现不仅为 mRNA 疫苗及疗法的储存和增效提供了新策略，也为脂质纳米载体的功能化设计开辟了新思路，有望推动基于冻融过程的智能纳米制剂技术发展。未来，针对 CPA 化学性质（如电荷、极性）的优化或可进一步拓展其在基因治疗、肿瘤免疫等领域的应用，为下一代 mRNA 药物的开发奠定关键基础。
