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本文利用假病毒平台对狂犬病毒糖蛋白（G）开展深度突变扫描，量化了所有单氨基酸突变对细胞 entry 和抗体中和的影响，鉴定出关键功能位点、构象变化相关位点及自然逃逸突变，为疫苗抗原和抗体疗法开发提供重要依据。
研究背景与方法
狂犬病由狂犬病毒引发，每年导致近 60,000 人死亡，暴露后 prophylaxis 包括免疫球蛋白、单克隆抗体或疫苗，但成本和供应问题显著。狂犬病毒糖蛋白（G）是疫苗和抗体的主要靶点，其突变可导致抗体失效。本研究利用假病毒深度突变扫描平台，分析了狂犬病毒巴斯德株 G 蛋白所有单氨基酸突变对细胞 entry（即病毒进入细胞的能力）和抗体中和的影响。该平台通过构建携带 G 突变体的慢病毒假病毒库，结合条形码测序，量化突变效应。
深度突变扫描技术与数据
研究针对 G 蛋白胞外域 433 个位点的 8,227 种单氨基酸突变及 20 个终止密码子突变进行扫描。假病毒库包含约 80,000 个条形码变体，覆盖超 99% 的目标突变。通过感染 293T 细胞，比较突变体与野生型 G 的细胞 entry 能力，发现突变效应呈双峰分布：多数突变中性或轻微有害，部分高度有害。例如，融合环（73-79 和 117-125 位）突变普遍有害，而融合域、第三连接子等区域对突变耐受性较高。验证实验显示，扫描结果与单突变假病毒滴度高度相关（ Pearson 相关系数 r=0.91）。
突变限制与结构功能关联
结合 G 蛋白结构（PDB:7U9G 等），发现突变限制与功能区域密切相关。二硫键位点 C189 和 C228 突变导致严重功能缺陷，疏水核心位点突变破坏折叠。融合环及其侧翼 β 链高度保守，F74、Y77、W121 等位点突变显著影响细胞 entry，而 Y119A 突变耐受性较高。组氨酸簇（H86、H173、H397）作为 pH 传感器，其突变严重损害功能，邻近苏氨酸（T60、T62 等）仅容忍丝氨酸突变。延伸中间构象中的极性和疏水作用位点（如 E45、D211、L46 等）突变也显著影响功能，提示这些位点可作为稳定前融合构象的潜在靶点。例如，H270P 突变锁定前融合状态，其他如 Q256P、L260P 等突变也有类似效果。
抗体逃逸突变图谱
针对 8 种单克隆抗体（包括临床应用的 17C7 和 CTB012），绘制了完整的逃逸突变图谱。抗体逃逸突变集中于抗原 - 抗体结合界面附近，但仅部分接触位点突变导致逃逸。例如，17C7 的逃逸突变主要位于 334、336-338 等位点，其中 I338T 通过引入糖基化位点影响抗原性。不同抗体的逃逸模式差异显著：靶向抗原区域 III 的 17C7 和 CR4098 逃逸位点相似，而 RVA122 和 RVC58 位点更独特；靶向区域 I 的 RVC20 和 CR57 逃逸位点部分重叠。广谱中和抗体（如 RVA122、RVC58）的逃逸位点更少或突变耐受性低，如 RVA122 主要逃逸位点 R333 在自然株中常见但常伴随致病性减弱。
自然株中的逃逸突变
分析 7,122 种自然狂犬病毒 G 序列发现，所有抗体的逃逸突变均存在于自然株中，但频率和逃逸强度差异显著。例如，17C7 的强逃逸突变（如 N336S、R346K）在自然株中频率较高，而 RVC20 的逃逸突变频率较低。通过 Nextstrain 系统发育树预测，部分蝙蝠和野生动物来源毒株携带强逃逸突变。实验验证显示，携带 I338T 或 R346S 突变的自然株对 17C7 完全或部分逃逸，证实扫描结果的准确性。
研究意义与应用
