在生命科学领域，蛋白质与代谢物的相互作用(PMI)如同细胞内的"分子对话"，调控着从酶活性到信号传递的众多生理过程。然而，由于技术限制，这些相互作用的全局图谱在模式生物中仍存在大量空白。传统方法如亲和纯化或热稳定性分析往往需要预先设计"诱饵"分子，而共馏分质谱(CF-MS)技术虽能无偏检测互作，却面临假阳性共洗脱的挑战——当一个代谢物与数百种蛋白质同时洗脱时，如何辨别真正的生物学互作成为关键难题。

为突破这一瓶颈，来自Boyce Thompson研究所、康奈尔大学和马克斯·普朗克分子植物生理研究所的研究团队创新性地将两种正交色谱技术——基于分子量的尺寸排阻色谱(PROMIS)与基于电荷特性的离子交换色谱(omniTICC)相结合，对大肠杆菌裂解液中的蛋白质-代谢物复合物进行系统性分离。这项发表于《iScience》的研究不仅构建了包含994个互作的高置信度网络，更发现了二肽调控脂代谢、光黄素影响生物膜形成等全新生物学机制，为理解代谢网络的动态调控提供了全新视角。

研究采用四项关键技术：1) 尺寸排阻色谱分离蛋白质复合物并检测共洗脱代谢物；2) 离子交换色谱结合热变性对照区分游离与结合态代谢物；3) 非靶向质谱分析鉴定蛋白质和代谢物；4) 微量热泳动(MST)和分子对接验证关键互作。实验选取对数生长期(OD₆₀₀=0.8)的大肠杆菌BW25113菌株制备裂解液，通过超速离心去除膜组分后分别进行色谱分离。

离子交换技术成功分离复杂裂解液中的蛋白质-代谢物复合物
通过比较天然样品(IEX_S)与热变性对照(IEX_C)的洗脱谱，研究人员建立了omniTICC分析流程，成功识别出58种已知代谢物与1479种蛋白质的共洗脱事件。相较于单一尺寸排阻分离，整合两种色谱方法使已知互作的检出率提升7.4倍，其中核苷酸单磷酸(NMP)和氨基酸类互作的验证效果最佳。值得注意的是，辅因子如NADH和FAD在两次重复实验中洗脱模式差异较大，提示其可能通过不同蛋白质载体发挥作用。

全局分析揭示蛋白质-代谢物互作组的功能洞察
通过设定Pearson相关系数(PCC)>0.8的严格阈值，研究构建了包含465个蛋白质与51个代谢物的互作网络。功能分析显示：1) NMPs与核糖体亚基显著共洗脱，暗示核苷酸可能直接调控翻译过程；2) 17种二肽(含13种支链氨基酸)与氨基酸代谢酶特异性互作，其中Val-Leu与脂肪酸合成酶FabF的结合通过MST验证具有12-14μM亲和力；3) 光黄素与嘧啶合成酶PyrE的互作可能源于进化保守性——该互作在拟南芥和酵母PROMIS数据中同样存在。

发现脂代谢与核苷酸合成中的调控性PMI
对二肽-FabF互作的深入分析显示，分子对接预测的Val-Leu结合位点与天然抑制剂platencin(PDB 3HO9)的位点重叠，提示其可能通过竞争性抑制调控脂肪酸延伸循环。更具突破性的是，研究者发现核黄素降解产物光黄素能以90.3μM亲和力结合PyrE，通过热位移实验(TSA)证实结合后，酶活分析显示100μM光黄素可抑制20% PyrE活性。由于PyrE催化5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)与乳清酸生成OMP，是尿苷酸合成的关键步骤，这种抑制最终导致大肠杆菌生物膜形成能力下降——通过刚果红结合实验证实，这与已报道的pyrE突变体表型一致。

这项研究通过多维色谱技术的创新整合，将CF-MS的假阳性率降低至传统方法的1/7，为大规模PMI鉴定建立了新标准。所发现的二肽-FabF互作为理解蛋白质降解产物如何调控脂代谢提供了分子线索，而光黄素-PyrE的调控轴则揭示了维生素代谢与嘧啶合成的交叉调控，为抗菌生物膜策略提供了新靶点。研究者特别指出，CF-MS技术的"非靶向"特性使其能发现如光黄素这类冷门代谢物的生物学功能，这是传统靶向方法难以实现的。

尽管该研究在稳定复合物检测方面表现优异，作者也坦承其可能遗漏瞬时互作，且不同色谱条件会偏好不同性质的相互作用。随着AlphaFold等蛋白质结构预测工具的进步，未来结合计算生物学与多组学技术，有望在更多生物体系中揭示PMI网络的动态特征及其生理意义。这项工作的核心价值在于证明正交分离策略可显著提升互作组学数据的可靠性，为解析代谢调控的分子机制开辟了新途径。