基于基因治疗的活性及耐药 MGMT 变异体筛选研究

为解决 MGMT P140K 变异体难以通过现有基因编辑技术可靠构建的问题，研究人员开展 MGMT 变异体研究。通过功能筛选等，鉴定出活性且 O6BG 耐药的 MGMT 变异体，建立变异体功能数据库与筛选平台，具重要意义。

　　

我们利用一种新兴功能测定法鉴定出可能通过碱基编辑产生的耐药 MGMT 蛋白变异体。这些变异体可引入工程化造血干细胞而无需病毒转导，以在清除天然造血干细胞的烷化剂治疗下促进其富集。
O6 - 甲基鸟嘌呤 - DNA 甲基转移酶（MGMT）可逆转 1,3 - 双（2 - 氯乙基）-1 - 亚硝基脲（BCNU）在鸟嘌呤 O⁶位诱导的烷基化甲基化。MGMT 可被 O⁶- 苄基鸟嘌呤（O6BG）不可逆抑制，而 Pro140Lys（P140K）变异体具有耐药性。在临床前研究中，将 O6BG/BCNU 与 MGMT P140K 基因转移至造血干细胞（HSCs）结合，可实现基因修饰 HSCs 的体内富集以产生治疗效果。然而，P140K 替换无法通过现有基因编辑方法可靠实现。鉴定对抑制剂耐药且适合基因编辑的功能性 MGMT 变异体，可实现 MGMT 和治疗位点编辑的 HSCs 体内富集。我们通过计算分析选择假定变异体，并生成 MGMT 变异体表达质粒库（pMGMTs）。在功能筛选中，我们用 O6BG 处理 MGMT 缺陷的 U251 细胞，并将其与 pMGMT 及包含 MGMT 活性荧光宿主细胞再激活报告质粒（mPlum_O⁶MeG）的质粒混合物共转染。MGMT 活性的流式细胞术分析鉴定出活性且 O6BG 耐药的 MGMT 变异体。用第二种 MGMT 抑制剂 PaTrin-2 处理证实了这些结果。我们还发现普通人群和肿瘤中可检测到的 MGMT 变异体具有活性且对 O6BG 敏感。总之，我们的研究结果建立了 MGMT 变异体功能数据库和基于细胞的平台，用于筛选具有未知功能特性的 DNA 修复蛋白。