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【编辑推荐】为解决植物病毒载体克隆方法和多克隆位点（MCS）不统一、传统策略工作量大等问题，研究人员开发 “一体化” 病毒载体工具包。整合 CLCrV、TRV 等，实现 VIGS、VOX、VIGE 等，简化流程，提升效率，为植物功能基因组学和育种提供新工具。
在植物功能基因组学研究与作物育种改良的广袤领域中，植物病毒表达载体如同精准的 “基因手术刀”，承担着外源基因递送与表达调控的关键使命。然而，当前领域面临着两大棘手难题：一方面，不同实验室开发的病毒载体克隆方法与多克隆位点（MCS）差异显著，难以整合形成统一的工具体系；另一方面，传统双生病毒与多分体病毒的农杆菌转化策略，需繁琐的混合菌培养与基因组共递送操作，尤其在高通量实验中，流程复杂性与工作量呈指数级增长。这些瓶颈严重制约了病毒载体在基因沉默、过表达及基因组编辑等核心应用中的效率提升。
为突破上述困境，中国农业科学院棉花研究所联合国家南繁研究院等机构的研究团队，将目光聚焦于两类经典的双生病毒载体系统 ——DNA 病毒棉花卷叶皱缩病毒（CLCrV）与 RNA 病毒烟草脆裂病毒（TRV），展开了一场创新性的 “载体革命”。研究团队历经多轮载体改造与功能验证，成功开发出首个集基因沉默（VIGS）、过表达（VOX）、瞬时表达（VATE）及基因组编辑（VIGE）等多功能于一体的植物病毒载体工具包，并将相关成果发表于《Plant Communications》。该工具包通过 “单 T-DNA 递送全基因组” 的颠覆性策略，彻底简化了传统病毒载体的操作流程，为植物基因功能研究与分子育种开辟了全新路径。
关键技术方法
研究以同源重组克隆技术为核心，构建含统一 2×BsaI-MCS 的一体化载体骨架。针对 CLCrV，将 VA 与 VB 基因组串联于单一质粒，利用共同区域（CR）介导环化；对 TRV，则通过双向排列 RNA1/RNA2 的 35S 表达盒并突变病毒编码区 BsaI 位点，消除酶切干扰。借助农杆菌浸润（agroinfiltration）技术，将重组载体导入棉花子叶与原生质体，结合 PCR、纳米孔测序验证病毒基因组稳定性，通过报告基因（如 EGFP、GUS）表达与表型观察评估载体效率。
研究结果
1. 一体化 VIGS 载体系统的构建与验证
- CLCrV-based VS 系统：串联 VA 与 VB 基因组，经农杆菌递送后，VS-GhPDS 成功诱导棉花子叶光漂白表型，且非接种幼叶中检测到环化病毒 DNA，证实单 T-DNA 可有效重构双生病毒基因组。
- TRV-based VS2 系统：双向排列 RNA1/RNA2 表达盒并优化酶切位点，VS2-GhCLA 侵染棉花后，21 天即显现叶绿体缺陷表型，VIGS 效率较原始载体提升 15%-20%。
- 统一克隆框架：VS 与 VS2 共享含 2×BsaI 的 MCS 及同源臂，支持 CLCrV 与 TRV 的兼容克隆，虽质粒克隆效率略有下降（尤其含毒性 RNA1 的 VS2），但仍满足单基因与高通量研究需求。
2. 多功能载体工具包的拓展开发
- VATE 应用（pVT 系列）：以 35S-MCS-NOS 表达盒替换 CLCrV 的 VB 运动基因，构建 pVT 载体。在烟草与棉花叶片中，成功驱动 EGFP、GUS 等报告基因的高效表达，且通过融合定位标签（如 pVTCLs、pVTHV3），验证了 AtbZIP63 蛋白的核定位与自我互作。
- VOX 与 VIGE 应用：pVS 直接作为 pVO 载体，通过框内插入目的基因实现过表达；利用 AtU6-26 启动子驱动 sgRNA，pVE 载体在 Cas9 转基因棉花中实现系统性体细胞编辑，突变率达 28%-35%。
3. 多基因操作与快速筛选技术
- VIGM-Combo 策略：在 pVS/MCS 中串联 VA 组件或 VIGS 片段，成功实现 GhSFT/GhSP 基因共过表达及双基因沉默，纳米孔测序证实载体在大肠杆菌与农杆菌中稳定性良好，为功能冗余基因研究与遗传通路解析提供新工具。
- proto-VIGS 快速筛选：基于双荧光素酶报告质粒 pVSr，在原生质体中 2 天内即可完成 VIGS 效率评估，成功筛选出棉花黄酮 O - 甲基转移酶（GhOMT1）的高效沉默片段，较传统农杆菌浸润法缩短周期 2-3 周。
4. 新型病毒载体的拓展与跨物种应用
- CCSV-based VS3 系统：从头改造棉花褪绿斑点病毒（CCSV）为一体化载体，VS3 诱导的基因沉默集中于生长点且无世代传递，提示其在瞬时编辑中的潜力。
- 跨物种兼容性：TRV-based VIGS 系统凭借 GhCLA 片段，成功在锦葵科近缘物种中诱导沉默，证实该工具包在多植物物种中的普适性。
研究结论与意义
本研究构建的 “一体化植物病毒载体工具包”，通过单质粒共递送双生病毒全基因组的创新设计，攻克了传统多分体病毒操作繁琐的技术壁垒，实现了 VIGS、VOX、VIGE 等核心功能的兼容与集成。其统一的克隆框架、高效的递送效率及跨物种适用性，不仅为植物功能基因组学研究提供了标准化工具，更在作物分子育种领域展现出广阔应用前景 —— 例如高通量基因编辑预筛选、多基因性状协同改良等。随着 VS2 系统克隆效率的进一步优化，该工具包有望成为植物生物技术领域的 “通用型平台”，推动基础研究与农业应用的深度融合，为 “设计育种” 时代的到来奠定关键技术基础。
